脂多糖對(duì)小鼠胰島NIT-1β細(xì)胞凋亡、增殖和功能的影響.pdf

1、胰島素分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要病理生理機(jī)制。導(dǎo)致2型糖尿病患者胰島素分泌缺陷的原因是β細(xì)胞功能下降以及β細(xì)胞的量減少，這是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。其中，慢性炎癥過(guò)程是一個(gè)重要的環(huán)境因素。慢性炎癥釋放的炎癥因子能抑制β細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制胰島素的合成和分泌。
　　 β細(xì)胞胰島素信號(hào)通路中胰島素受體底物-2(IRS-2)的變化，影響β細(xì)胞功能和存活。下調(diào)IRS-2的表達(dá)或干擾其酪氨酸磷酸化能抑制β

2、細(xì)胞的增殖、胰島素的合成和分泌；上調(diào)IRS-2的表達(dá)則能促進(jìn)β細(xì)胞的增殖，拮抗β細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)胰島素的分泌。炎癥因子可通過(guò)多條途徑抑制IRS-2的酪氨酸磷酸化，以及促進(jìn)IRS-2的降解。
　　 2型糖尿病患者慢性炎癥激活的原因和機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。其中，腸道細(xì)菌產(chǎn)物脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可能參與了2型糖尿病患者慢性炎癥的激活。脂多糖也被稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌(G-菌)外膜的主要成分，在

3、G-菌破解后得以釋放。人體腸道中含有大量G-菌，可持續(xù)產(chǎn)生大量的LPS。高脂飲食能促進(jìn)LPS吸收，引起血漿LPS水平升高。2型糖尿病患者在沒(méi)有明顯全身感染證據(jù)的情況下，與姓別、年齡和BMI匹配的非糖尿病者相比，血漿中LPS水平明顯升高。
　　 LPS在單核巨噬細(xì)胞膜上的CD14協(xié)助下與TLR4/MD2受體復(fù)合物結(jié)合，激活TLR4信號(hào)通路。其中，通過(guò)激活I(lǐng)KK，引起NF-κB的激活，啟動(dòng)多種炎癥因子的表達(dá)。LPS也被發(fā)現(xiàn)能通過(guò)激活

4、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞中的IKK，激活NF-κB，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，引起胰島素抵抗。多項(xiàng)研究已證實(shí)，胰島β細(xì)胞表達(dá)完整的LPS認(rèn)別受體——CD14、TLR4和MD2。而且，LPS能上調(diào)胰島β細(xì)胞IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。
　　 因此，我們推測(cè)LPS可作用于β細(xì)胞表面的受體，通過(guò)激活I(lǐng)KK，誘導(dǎo)IκB磷酸化，激活NF-κB，干擾IRS-2的表達(dá)和酪氨酸磷酸化，影響β細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和

5、功能。
　　 研究目的:
　　 觀察LPS對(duì)NIT-1β細(xì)胞凋亡、增殖和胰島素分泌功能的影響，并初步探討其可能機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容
　　 1.檢測(cè)LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響。
　　 2.檢測(cè)LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞增殖的影響。
　　 3.檢測(cè)LPS對(duì)NTI-1細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、基礎(chǔ)及高糖刺激后胰島素分泌的影響。
　　 4.檢測(cè)LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞IRS-2蛋白表達(dá)水平以

6、及酪氨酸磷酸化水平的影響。
　　 5.檢測(cè)LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞IκBα蛋白磷酸化水平的影響，以及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系。
　　 研究方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 DMEM低糖培養(yǎng)基添加10％胎牛血清(內(nèi)含內(nèi)毒素≤1ng/ml)用于小鼠胰島NIT-1β細(xì)胞株(20-40代)的培養(yǎng)。
　　 2.LPS干預(yù)濃度的確定
　　 細(xì)胞培養(yǎng)24h后換液，分別加入終濃度為0.1、0.5、1、5、10μg

7、/ml的LPS作用120h，普通顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目，以及用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的總活力，取影響細(xì)胞總活力的最小有效濃度作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 3.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
　　 1μg/ml LPS作用120h后，分別以Hochest33342染色后熒光顯微鏡下人工計(jì)數(shù)以及Annexin V/PI染色后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。
　　 4.細(xì)胞增殖的檢測(cè)
　　 1μg/ml LPS作用24、48、72

8、、96、120h后，分別以CCK-8試劑盒和BrdUELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖。
　　 5.胰島素的檢測(cè)
　　 1μg/ml LPS作用24、48、72、96、120h后，放免法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、葡萄糖刺激后的胰島素分泌和24h的胰島素基礎(chǔ)分泌。
　　 6.IRS-2蛋白和酪氨酸磷酸化的檢測(cè)
　　 1μg/ml LPS作用120 h后，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IRS-2的蛋白表達(dá)水平，

9、免疫沉淀后Westem blot法檢測(cè)IRS-2蛋白的酪氨酸磷酸化水平。
　　 7.IκBα蛋白磷酸化的檢測(cè)，及其與細(xì)胞增殖關(guān)系
　　 1μg/ml LPS作用0、30、60、120 min后，Western blot法檢測(cè)IκBα蛋白及其磷酸化水平。以IκBα磷酸化抑制劑(Bay11-7082)預(yù)處理1h，再加入LPS作用1h后，檢測(cè)IκBα蛋白及其磷酸化水平。Bay11-7082預(yù)處理1h，再加入LPS作用24h后，

10、CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　 8.統(tǒng)計(jì)分析
　　 實(shí)驗(yàn)相同條件下至少重復(fù)3次。結(jié)果數(shù)據(jù)以SPSS13.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.鏡下觀察NIT-1細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目
　　 LPS(0.1～10μg

11、/ml)作用120h后，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組相近，LPS1、5、10μg/ml組細(xì)胞數(shù)目明顯減少。
　　 2.LPS對(duì)細(xì)胞總活力的影響
　　 與對(duì)照組比較，LPS0.1、0.5μg/ml組細(xì)胞總活力無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，LPS1、5、10μg/ml組細(xì)胞總活力明顯下降(P＜0.01)。LPS1、5、10μg/ml組間兩兩比較，細(xì)胞總活力無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞凋亡的影響
　　 1μg/

12、ml LPS作用120h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Hoechst33342：對(duì)照組2.05±0.34％，LPS組2.36±0.36％，P=0.349；流式：對(duì)照組1.93±0.65％，LPS組4.34±1.60％，P=0.072)。
　　 4.LPS對(duì)NIT-1細(xì)胞增殖的影響
　　 CCK-8和BrdU檢測(cè)均顯示：1μg/ml LPS作用24、48h，細(xì)胞增殖明顯高于對(duì)照組，約上升9-30％(P＜0.

13、05)；LPS作用72h，細(xì)胞增殖與對(duì)照料組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LPS作用96、120h，細(xì)胞增殖明顯低于對(duì)照組，約為對(duì)照組的80％(P＜0.01)。
　　 5.LPS對(duì)胰島素合成和分泌的影響
　　 1μg/ml LPS作用24、48、72、96、120h，與對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、葡萄糖(2.8、11.1mmol/l)刺激1h后的胰島素分泌以及胰島素分泌指數(shù)均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。LPS作用24h后，與對(duì)照組比較，

14、細(xì)胞24h的基礎(chǔ)胰島素分泌量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LPS作用48、72、96、120h，細(xì)胞24h的胰島素基礎(chǔ)分泌量明顯小于對(duì)照組，約為對(duì)照組的80％(P＜0.01)。
　　 6.LPS對(duì)IRS-2蛋白的影響
　　 1μg/ml LPS作用120h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)IRS-2蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(對(duì)照組2.11±0.22，LPS組1.93±0.15，P=0.313)，而IRS-2蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯下降，

15、約降低51％(對(duì)照組0.45±0.08，LPS組0.22±0.06，P=0.016)。
　　 7.LPS對(duì)IκBα磷酸化的影響及其與細(xì)胞增殖的關(guān)系
　　 1μg/ml LPS作用1h后，IκBα蛋白的磷酸化水平明顯升高(P＜0.05)。Bay11-7082預(yù)處理后，LPS促進(jìn)的IκBα蛋白磷酸化以及細(xì)胞增殖均明顯受抑制(P＜0.01)。
　　 研究結(jié)論:
　　 LPS參與調(diào)節(jié)小鼠NIT-1β細(xì)胞的增殖和胰