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文檔簡介
1、目的:以建立胰島素瘤NIT-1細胞血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)基因沉默模型為基礎,研究AT1受體調控鏈脲佐菌素(STZ)誘導的胰島β細胞凋亡的變化效應,并以此角度探討厄貝沙坦拮抗STZ誘導胰島β細胞凋亡的保護機制。
方法:(1) AT1R基因沉默細胞模型:采用siRNA干擾技術沉默AT1R:針對小鼠AT1R,設計并合成3對siRNA干擾序列,以脂質體為載體轉染至NIT-1細胞。用不同濃度的標記熒光分子的siRNA序列轉染細
2、胞,熒光顯微鏡觀察熒光強度檢測轉染效率;Ral-time PCR檢測AT1R mRNA表達量判斷不同干擾序列及干擾時間的基因沉默效果。(2)實驗分組:①空白組,②STZ組,③厄貝沙坦+STZ組,④si-AT1R組,⑤si-AT1R+ STZ組,⑥si-AT1R+厄貝沙坦+STZ組,以5mM STZ干預30min特異性損傷NIT-1細胞誘導細胞凋亡;厄貝沙坦干預時先用0.01mM厄貝沙坦孵育細胞2h,再用5 mM STZ誘導細胞凋亡,然后
3、換含0.01 mM厄貝沙坦的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。實驗重復3-6次。(3)檢測指標:①細胞凋亡觀察:采用Hoechst33342染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況,②細胞凋亡率檢測:AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式細胞術檢測,③Caspase-3、NADPH表達:Real-time PCR檢測各實驗組細胞的Caspase-3、NADPH mRNA表達量。
結果:(1)40nM siRNA轉染的熒光強度最強,轉染后AT1
4、R mRNA表達量明顯減少,干擾序列si-AT1R-2轉染24h的沉默效果最佳(92.20%)。(2)①細胞凋亡率:與空白組比較,STZ組凋亡明顯升高(P<0.05);與STZ組相比,厄貝沙坦+STZ組凋亡明顯降低(P<0.05);與空白組比較,si-AT1R組凋亡無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與STZ組相比,si-AT1R-2+STZ組凋亡減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與si-AT1R-2組相比,si-AT1
5、R-2+STZ組凋亡升高(P<0.05);與si-AT1R-2+STZ組相比,si-AT1R-2+厄貝沙坦+STZ組凋亡減少(P<0.05);沉默AT1R后,厄貝沙坦減少細胞凋亡率的幅度降低了,即其抗凋亡的能力下降了,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。②Caspase-3、NADPH mRNA表達量:與空白組比較,STZ組兩指標均明顯升高(P<0.05);與STZ組相比,厄貝沙坦+STZ組兩指標均明顯降低(P<0.05);與空白組比較,
6、si-AT1R組兩指標無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與STZ組相比,si-AT1R-2+STZ組Caspase-3 mRNA表達量有減少趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),NADPH mRNA表達量無明顯變化;與si-AT1R-2組相比,si-AT1R-2+STZ組兩指標均升高(P<0.05);與si-AT1R-2+STZ組相比,si-AT1R-2+厄貝沙坦+STZ組兩指標均減少(P<0.05):沉默AT1R后,C
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