GDNF受體RET與信號分子Rap1GAP相互作用及其功能的研究.pdf

1、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)家族包括GDNF、NRTN(neurturin)、ARTN(artemin)、PSPN(persephin)四個成員。它們不僅可以支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦多巴胺能神經(jīng)元與運動神經(jīng)元等多種神經(jīng)元的存活和發(fā)育,還支持許多外周神經(jīng)元如交感、副交感、感覺與腸道神經(jīng)元等的存活并調(diào)節(jié)其分化。除神經(jīng)系統(tǒng)外,GDNF還是腎臟發(fā)育中的重要的形態(tài)形成因子,并在精原細胞分化過程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。目前發(fā)現(xiàn)的GDNF受體有三個:

2、GFRα1、RET和NCAM,而RET是其最主要的功能受體。酪氨酸激酶類受體RET被GDNF激活后,發(fā)生二聚化和自磷酸化,繼而募集下游信號分子,通過一系列的酶促級聯(lián)反應(yīng),最終激活Ras/MAPK、P13-K以及PLCγ等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控神經(jīng)元的生長、分化、存活等生物學(xué)效應(yīng)。 Rap1GAP可以和不同類型蛋白相互作用形成復(fù)合物。以往研究認為GPCR類受體Gao和Gai都分別能與Rap1GAP相互作用,Gao受體結(jié)合Rap1GAP

3、,導(dǎo)致Rap1活化,而Gai與RaplGAPII結(jié)合則抑制Rap1活性,說明Rap1GAP和不同蛋白結(jié)合可以產(chǎn)生截然相反的效應(yīng)。而以往對小G蛋白的GAP分子在RTK類受體信號通路的研究,發(fā)現(xiàn)RasGAP通過結(jié)合Dok2分子間接參與pTrkA和pEGFR信號的負調(diào)控,其通過抑制ERK途徑的瞬時激活,負調(diào)控細胞的增殖效應(yīng)；而Rap1/ERK在RTK類受體下游被持續(xù)激活,是參與神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)控細胞分化效應(yīng)的保守途徑,Sasagawa S等應(yīng)用

4、數(shù)學(xué)計算的方法,證明Rap1GAP在TrkA下游沒有被pTrkA激活,其在胞漿一直保持基礎(chǔ)的活性狀態(tài)。所以至今尚無任何報導(dǎo)提出Rap1GAP可以參與調(diào)控RTK類受體下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。我們在前期研究中,用RET胞內(nèi)域為誘餌經(jīng)酵母雙雜交篩選人腦cDNA文庫,獲得RET與Rap1GAP結(jié)合線索。本研究進一步探明RET與Rap1GAP是否確實存在生理結(jié)合,并探索二者結(jié)合的生物學(xué)意義,深入了解受體結(jié)合蛋白如何影響受體的定位和功能將有利于加速GDNF應(yīng)

5、用和發(fā)展的進程。 本研究的主要結(jié)果如下： 1、為了驗證Rap1GAP和RET受體結(jié)合是否具有特異性,尋找關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域,我們運用PCR方法擴增人源性Rap1GAP全長和各個主要區(qū)段(N段,GAP區(qū),C段)cDNA,克隆入AD載體。通過酵母雙雜交方法檢測Rap1GAP與RET、TrkA、EGFR胞內(nèi)域結(jié)合情況。結(jié)果表明,Rap1GAP全長與RET胞內(nèi)域結(jié)合能力強,與TrkA結(jié)合微弱,與EGFR不結(jié)合；各個主要區(qū)段單獨不能跟R

6、ET結(jié)合。β-半乳糖苷酶活力液相測活實驗顯示Rap1GAP全長與RET胞內(nèi)域結(jié)合能力強,和系統(tǒng)陽性對照相仿。此結(jié)果為RET和Rap1GAP在體可能存在結(jié)合提供線索。 2、為了確證內(nèi)源性兩蛋白是否能夠結(jié)合,首先用免疫印跡方法檢測了RET和Rap1GAP在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)各分區(qū)及細胞系中的表達,結(jié)果顯示:Rap1GAP在成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)各分區(qū)廣泛分布,PC12細胞系里也能檢測到,只有3T3細胞里未檢測到表達。而RET在成年大鼠中

7、樞神經(jīng)系統(tǒng)中的中腦,小腦,脊髓,下丘腦富含,皮層,海馬,PC12,3T3細胞里未檢測到。免疫共沉淀方法確證,在大鼠腦、脊髓組織裂解液中,內(nèi)源性的Rap1GAP與RET能夠發(fā)生結(jié)合。此結(jié)果為兩蛋白可能存在生理結(jié)合提供有力證據(jù)。 3、為了明確RET和Rap1GAP在天然狀態(tài)是否存在空間共定位,利用熒光免疫組織(細胞)化學(xué)方法,觀察了RET和Rap1GAP在大鼠脊髓、中腦的分布。結(jié)果表明:RET在脊髓前角和后角邊緣核中表達量高,Rap

8、1GAP在脊髓呈現(xiàn)神經(jīng)元特異性分布,RET和Rap1GAP在脊髓神經(jīng)元內(nèi)存在大量共定位。原代培養(yǎng)中腦神經(jīng)元,觀察單個細胞內(nèi)兩個蛋白分布情況,結(jié)果表明,Rap1GAP和RET在多巴胺神經(jīng)元突起和胞體里都存在共定位。此結(jié)果說明兩個蛋白存在生理結(jié)合,提示此結(jié)合可能具有重要生理意義。 4、為了確證兩蛋白結(jié)合是否受配體調(diào)控,利用免疫共沉淀方法,檢測GDNF刺激PC12-rGFRal-RET穩(wěn)定細胞株后RET和Rap1GAP結(jié)合情況,結(jié)果顯

9、示二者結(jié)合在配體刺激后顯著增強,說明二者結(jié)合是配體依賴性的,進一步提示Rap1GAP和RET結(jié)合參與調(diào)節(jié)GDNF引起的生物學(xué)效應(yīng)。 5、為了探測兩蛋白結(jié)合的生理意義,構(gòu)建EGFP-Rap1GAP亞克隆,瞬時轉(zhuǎn)染PC12-rGFRal-RET穩(wěn)定細胞株,以空載體EGFP轉(zhuǎn)染組做對照。結(jié)果表明,Rap1GAP過表達明顯抑制GDNF誘導(dǎo)的細胞分化。為了進一步明確Rap1GAP蛋白的作用,我們設(shè)計并合成了三段siRNA序列,用weste

10、rn方法確定了有效沉默Rap1GAP基因的序列,之后將其轉(zhuǎn)染細胞,用GDNF后刺激觀察細胞分化效應(yīng)。結(jié)果表明,敲減Rap1GAP基因表達后,GDNF誘導(dǎo)的細胞分化效應(yīng)明顯增加,說明內(nèi)源性的Rap1GAP在GDNF誘導(dǎo)細胞分化過程中起到負性調(diào)節(jié)作用。 6、為了深入了解Rap1GAP與RET結(jié)合在神經(jīng)系統(tǒng)的生理意義,分離培養(yǎng)大鼠胚胎14天中腦神經(jīng)元,將Rap1GAP基因敲減或過表達,GDNF刺激3天后計量神經(jīng)元最長突起的長度。結(jié)果顯

11、示,Rap1GAP過表達抑制GDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元突起生長,而Rap1GAP基因敲減可以顯著促進GDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元突起生長。此結(jié)果說明,Rap1GAP對GDNF誘導(dǎo)的神經(jīng)元的分化起到負性調(diào)控作用。 7、為深入探討Rap1GAP發(fā)揮作用的機制,觀察了GDNF下游主要信號通路的抑制劑對細胞分化效應(yīng)的影響。結(jié)果表明,GDNF誘導(dǎo)Rap1GAP基因沉默細胞過度分化效應(yīng),可以被ERK信號通路抑制劑顯著抑制。而將Rap1GAP基因過表達,G

12、DNF刺激不同時間,western結(jié)果也顯示,ERK的活化和Rap1的活化也受到抑制。以上結(jié)果表明,Rap1GAP蛋白對GDNF信號的調(diào)節(jié),主要是影響了下游ERK途徑。 8、為了明晰Rap1GAP是否通過其它機制調(diào)控GDNF信號通路,利用表達內(nèi)源性RET,Rap1GAP,GFRal蛋白的SH-SY5Y細胞系,觀察GDNF刺激后RET和Rap1GAP分布變化。免疫熒光細胞化學(xué)實驗顯示,GDNF不刺激情況下,Rap1GAP彌散分布在

13、SH-SY5Y細胞胞漿里,RET大部分分布在細胞膜上。GDNF刺激SH-SY5Y細胞10分鐘后,RET有大量內(nèi)化現(xiàn)象,Rap1GAP和RET可以在同一早期內(nèi)吞體里檢測到；GDNF刺激細胞不同時間,用strepavidin-biotin沉淀細胞膜蛋白,western檢測膜蛋白里RET的剩余量。結(jié)果顯示,Rap1GAP過表達情況下,GDNF刺激細胞后,RET在細胞膜內(nèi)表達維持時間最長,GDNF刺激15分鐘后膜上仍能檢測到RET:而Rap1G

14、AP沉默組,GDNF刺激5分鐘后,細胞膜里幾乎檢測不到RET。以上結(jié)果說明,Rap1GAP的表達量明顯影響GDNF引起的RET內(nèi)化過程。 9、為了明確Rap1GAP介導(dǎo)的Rap1活性抑制在調(diào)制GDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,我們構(gòu)建喪失抑制Rap1活性的突變EGFP-Rap1GAP(N290A)和pB42AD-Rap1GAP(N290A)。將EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP分別轉(zhuǎn)染細胞,KCL刺激后,檢

15、測細胞裂解液中Rap1活性,結(jié)果顯示我們構(gòu)建的EGFP-Rap1GAP(N290A)突變體確實喪失了抑制Rap1的催化活性作用。酵母雙雜交β-半乳糖苷酶活力檢測,突變體Rap1GAP(N290A)和野生型Rap1GAP與RET結(jié)合能力類似。構(gòu)建EGFP-Rap1GAP(N290A)質(zhì)粒,并和EGFP-Rap1GAP分別轉(zhuǎn)染細胞,免疫共沉淀結(jié)果證明,Rap1GAP(N290A)和RET結(jié)合在GDNF刺激后結(jié)合增強。以上結(jié)果提示,Rap1G

16、AP與RET結(jié)合不依賴GAP區(qū)的催化活性。 10、為了明確缺失GAP催化活性后,Rap1GAP對GDNF效應(yīng)的影響,我們將EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP分別轉(zhuǎn)染SH-SY5Y、PC12-rGFRαl-RET細胞系或者大鼠中腦神經(jīng)元,GDNF刺激三天后,熒光拍照檢測細胞突起延伸情況。統(tǒng)計結(jié)果顯示,EGFP-Rap1GAP(N290A)和EGFP-Rap1GAP具有相似的抑制細胞分化的作用,二者之間

17、的微弱不同不足以引起統(tǒng)計學(xué)差異。轉(zhuǎn)染EGFP-Rap1GAP(N290A)或者EGFP-Rap1GAP,GDNF刺激細胞不同時間后,檢測細胞裂解液中Rap1和ERK活性。結(jié)果顯示,兩者抑制下游ERK、Rap1活性的效果相類似。此結(jié)果說明Rap1GAP抑制GDNF引起的細胞分化效應(yīng)和ERK的激活,并不依賴其GAP區(qū)的催化活性。免疫熒光實驗和biotin實驗結(jié)果表明,EGFP-Rap1GAP(N290A)過表達,抑制GDNF誘導(dǎo)的RET內(nèi)化