Rap1GAP通過ERK和Akt途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:Rap1是小分子G 蛋白R(shí)as 家族成員之一，體外的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明 Rap1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮多種作用。Rap1 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用主要是參與對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞間粘連形成、通透性等功能的調(diào)節(jié)。最近的研究表明，在內(nèi)皮細(xì)胞中，Rap1 不僅僅局限于細(xì)胞粘連，而且可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)一些促進(jìn)血管新生刺激因素的反應(yīng)。換句話說(shuō)，Rap1在體內(nèi)可以作為一種正性血管新生調(diào)節(jié)因素。Rap1GAP是小分子G 蛋白R(shí)ap1的GTP 酶激活蛋白，它可以加速Rap1 由

2、與GTP結(jié)合的活化形式轉(zhuǎn)變?yōu)榕cGDP 結(jié)合的去活化形式的過程。一些研究者發(fā)現(xiàn)Rap1GAP可以失活Rap1，抑制Rap1 介導(dǎo)的血管新生。但也有一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不支持這一結(jié)論。因此，很有必要進(jìn)一步研究Rap1GAP在血管新生的作用。揭示Rap1GAP在血管新生的作用有利于進(jìn)一步了解血管新生的機(jī)理，并且能為與血管新生相關(guān)疾病提供一個(gè)新的、特異的研究切入點(diǎn)。
　　 血管新生是微血管從已經(jīng)存在的血管床以出芽的方式長(zhǎng)出,并逐漸形成新的血管

3、分支及毛細(xì)血管叢的過程，它由一系列相互協(xié)調(diào)密切配合的過程來(lái)組成的，許多因素參與了對(duì)其的調(diào)節(jié)。PI3K/Akt和ERK 信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞的有絲分裂、代謝運(yùn)動(dòng)、生存、凋亡和分化等過程。其在血管新生中的作用也越來(lái)越受到重視。所以，設(shè)想Rap1GAP是通過PI3K/Akt和ERK 信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)其在血管新生中的作用。
　　 本研究的目的就在于研究Rap1GAP在血管新生中的作用機(jī)理。研究方法首先通過人臍靜脈獲得內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)其培養(yǎng)、擴(kuò)

4、增。利用Fugene 6 轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，使其高表達(dá)Rap1GAP。然后通過BrdU-ELISA 方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Rap1GAP后，內(nèi)皮細(xì)胞增殖變化情況，利用Transwell 小室測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力，通過體外管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微血管樣結(jié)構(gòu)的形成情況。
　　 為了研究Rap1GAP 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的機(jī)理及信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過免疫印跡的方法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Rap1GAP后ERK、Akt 磷酸化的變化情況。同時(shí)進(jìn)一步觀察ERK和

5、Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路特異拮抗劑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖、遷移的影響。最后，對(duì)轉(zhuǎn)染有Rap1GAP的HUVECs 給予外源性VEGF 刺激后觀察其增殖、Cyclin D1以及ERK、Akt 磷酸化的變化情況，從而研究Rap1GAP 對(duì)VEGF 促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖是否影響及作用機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.高表達(dá)的Rap1GAP 能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和體外管腔形成能力。
　　 2.Rap1GAP 能夠抑制Rap