與雌激素受體相互作用蛋白FHL2的功能研究.pdf

1、雌激素受體(estrogen receptor，ER)是核受體超級(jí)家族成員之一，它包括兩種亞型：α和β。兩種亞型在結(jié)構(gòu)上基本相似，均分為4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，即轉(zhuǎn)錄激活區(qū)AFl和AF2，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)及位于D區(qū)的鉸鏈區(qū)。AF1具有配體(雌激素)不依賴的轉(zhuǎn)錄激活功能，AF2具有配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活功能。AF1和AF2的有效轉(zhuǎn)錄激活均依賴于與其它蛋白質(zhì)的相互作用，ER通過AF1和AF2相互協(xié)同作用調(diào)控雌激素應(yīng)答的基因表達(dá)。ER在乳腺癌的

2、發(fā)生發(fā)展中起重要作用，乳腺癌內(nèi)分泌的治療主要是通過降低ER轉(zhuǎn)錄活性而實(shí)現(xiàn)。因此調(diào)節(jié)ER轉(zhuǎn)錄活性的蛋白因子的發(fā)現(xiàn)和相應(yīng)的功能研究對(duì)于探討乳腺癌的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防乳腺癌的發(fā)生、有效開發(fā)治療與雌激素相關(guān)疾病的藥物具有重大意義。 以ERβAF1(1-145aa)為誘餌，用酵母雙雜交技術(shù)從人乳腺cDNA文庫中分離到了未曾報(bào)道的與ERβ相互作用的蛋白質(zhì)FHL2。FHL2是FHL家族蛋白成員，含4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域，LIM結(jié)構(gòu)域的雙鋅指結(jié)構(gòu)廣泛地

3、介導(dǎo)了蛋白-蛋白間的相互作用。 為進(jìn)一步確認(rèn)FHL2與ER之間存在特異性的蛋白質(zhì)間相互作用，我們進(jìn)行了GST沉降和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，F(xiàn)HL2和ERa、ERβ在體外和體內(nèi)都存在相互作用，獲得了與酵母雙雜交結(jié)果相一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過FHL2和ER不同功能域缺失的系列突變體，揭示了FHL2和ER發(fā)生相互作用的結(jié)合區(qū)域，F(xiàn)HL2 N端的半個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域就能與ER結(jié)合，F(xiàn)HL2與ERβ的AF1區(qū)結(jié)合，與ERa的AF2區(qū)結(jié)合。FHL

4、2同一家族的另外2個(gè)成員FHL1、FHL3也能與ER相互作用。 在轉(zhuǎn)染含雌激素應(yīng)答元件的ERE熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，F(xiàn)HL2能以劑量依賴、的方式抑制ER介導(dǎo)的ERE熒光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。通過活性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FHL2抑制雌激素應(yīng)答元件的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的功能依賴于ER的存在，而且不是通過影響ER的表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。 為了深入研究FHL2基因的功能，我們制備了抗FHL2的鼠多克隆抗體，并利用該抗體檢測(cè)了FHL2在大鼠

5、不同組織及其乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)。隨后我們構(gòu)建了有效的FHL2 siRNA真核表達(dá)載體，將RNAi實(shí)驗(yàn)與活性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)抑制FHL2的表達(dá)后，F(xiàn)HL2抑制雌激素應(yīng)答元件的報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性的功能也受到抑制。同時(shí)在乳腺癌細(xì)胞株T47D中構(gòu)建了FHL2過表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，再次從正反兩方面驗(yàn)證了FHL2能抑制ER報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，由此推測(cè)FHL2是ER的共抑制子。本實(shí)驗(yàn)室已證明FHL2與Smad4也存在相互作用，另有文獻(xiàn)表明Sma