蛋白質(zhì)分子進(jìn)化及其與分子內(nèi)相互作用的關(guān)系.pdf

1、蛋白質(zhì)的進(jìn)化和分子內(nèi)（間）相互作用緊密聯(lián)系。一方面，蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中似乎傾向于保持一些關(guān)鍵相互作用，相關(guān)突變即屬于這種情況。另一方面，蛋白質(zhì)的進(jìn)化又必須通過改變分子內(nèi)（間）的相互作用來實(shí)現(xiàn)。對蛋白質(zhì)分子進(jìn)化和分子內(nèi)相互作用關(guān)系的研究，對于揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化的機(jī)理，都具有十分重要的理論意義。本論文從以下四個方面研究蛋白質(zhì)的分子進(jìn)化和分子內(nèi)相互作用的關(guān)系。 （一）根據(jù)進(jìn)化相關(guān)性預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用面

2、 我們開發(fā)了一個基于序列的、通過比較分析進(jìn)化樹來預(yù)測相互作用面的方法。首先，將存在相互作用的兩個亞基家族的序列比對好，并使得兩個家族具有相同的序列數(shù)和序列順序。然后，各使用一個長度適中的窗口在兩個亞基家族序列上進(jìn)行滑動，給出兩個家族亞基的多個序列片斷。在進(jìn)一步計(jì)算每個序列片斷的距離矩陣后，估算兩個亞基之間的所有可能的成對片斷對應(yīng)的距離矩陣之間的相關(guān)系數(shù)。最后，通過設(shè)定一個閾值，選擇相關(guān)系數(shù)大于閾值的成對片斷作為可能的相互作用面。

3、 首先，我們使用絲氨酸蛋白酶枯草桿菌素（subtilisin）為分子內(nèi)相互作用面預(yù)測的例子，以捕光色素蛋白藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）為亞基間相互作用面預(yù)測的例子，介紹了PIFPAM法預(yù)測相互作用面的步驟。之后，我們詳細(xì)分析了窗口長度選擇、序列選擇、閾值選擇等多項(xiàng)因素對預(yù)測結(jié)果的影響，找到了較為優(yōu)化的參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，我們使用PIFPAM法預(yù)測了12個家族蛋白或復(fù)合物的相互作用面。對分子內(nèi)相互作用面預(yù)測的精確度是0.41～

4、0.71，對亞基間相互作用面預(yù)測的精確度為0.07～0.60。與已報道的方法相比，在相同條件下，此方法在11個家族中預(yù)測到了更多的相互作用位點(diǎn)對，并且在其中的8個家族中可以比其他方法多預(yù)測超過34％的位點(diǎn)對，顯示了此方法的優(yōu)越性，同時也表明此方法可以推廣到其他家族的研究中去。由于此方法僅需要氨基酸序列信息，因此，尤其適用于那些尚未獲得三維結(jié)構(gòu)的蛋白家族。對于那些已有部分結(jié)構(gòu)信息的家族，可以通過整合已知結(jié)構(gòu)信息提高預(yù)測的精確度。即使對那些

5、完全已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白，此方法也可以用于分析在結(jié)構(gòu)中相互接觸的作用面兩側(cè)在進(jìn)化上相關(guān)性的高低。 綜上，本論文出了一種僅使用進(jìn)化信息（序列信息）預(yù)測蛋白質(zhì)相互作用面的新方法-PIFPAM法。PIFPAM法對8個家族蛋白質(zhì)分子內(nèi)相互作用面預(yù)測的精確度為0.41-0.71，對4個亞基間相互作用面預(yù)測的精確度為0.07-0.60。與已經(jīng)報道的方法相比，在11個（共12個）蛋白家族的預(yù)測中超過了其他方法，并且在其中的8個家族中可以比其他方

6、法多預(yù)測34％以上的位點(diǎn)對。此外，本章系統(tǒng)討論了不同參數(shù)條件對預(yù)測結(jié)果的影響。PIFPAM法是第一種不依賴蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測相互作用面的方法，因此對尚未解析三維結(jié)構(gòu)的蛋白尤其有用。 （二）改進(jìn)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)化相關(guān)性分析方法 在本研究中，我們提出了一個基于PAM模型模擬產(chǎn)生具有特定進(jìn)化歷史序列的方法。通過此方法，我們可以產(chǎn)生多套與擬分析蛋白序列具有相同（至少高度相似）進(jìn)化歷史的序列。通過分析這些模擬產(chǎn)生的序列之間相關(guān)系數(shù)的分

7、布，可以獲得在相同進(jìn)化歷史下條件下，隨機(jī)、獨(dú)立進(jìn)化獲得擬分析蛋白之間相關(guān)系數(shù)的概率，即P值。若P值?。ㄈ鏟<0.05），我們可以推測兩個蛋白在進(jìn)化過程中很可能存在相互作用。 我們構(gòu)建了PC的α和β亞基融合序列的鄰接樹作為引導(dǎo)樹，模擬產(chǎn)生了1000套融合序列，并計(jì)算了各模擬樹與引導(dǎo)樹之間的相似性?？傮w上，模擬樹與引導(dǎo)樹具有很高的相似性，相關(guān)系數(shù)為0.864±0.021。各模擬樹之間的相關(guān)系數(shù)為0.824±0.039。上述結(jié)果表明此

8、模擬方法得到的模擬序列與原始序列具有相似進(jìn)化歷史，因此可以用于下一步的P值計(jì)算。 PC（αβ）單體內(nèi)亞基間有很大的相互作用面，根據(jù)相關(guān)突變的基本思想，作用面之間應(yīng)該具有協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系。我們計(jì)算了兩個亞基作用面之間的相關(guān)系數(shù)，為0.515，模擬序列的相關(guān)系數(shù)為0.266±0.135。通過位點(diǎn)間獨(dú)立、隨機(jī)進(jìn)化得到不小于相關(guān)系數(shù)0.515的概率僅為P=0.029，在統(tǒng)計(jì)上顯著，說明相互作用面的位點(diǎn)在進(jìn)化上存在相關(guān)性。 但是對P

9、C的α亞基全長和β亞基全長之間相關(guān)系數(shù)的計(jì)算表明，盡管兩者具有很高的相關(guān)系數(shù)0.644，但是它的P值高達(dá)0.802，說明此相關(guān)系數(shù)主要來源于兩個亞基之間的共同進(jìn)化歷史。PC的相互作用面在進(jìn)化過程中存在相互作用，但是整體亞基卻無法得到顯著的相互作用信號，這可能有兩方面原因。一個原因可能是擬分析序列的共同進(jìn)化歷史信號太強(qiáng)，掩蓋了相互作用信號。另一個可能的原因是蛋白內(nèi)相互作用面外其他區(qū)域的進(jìn)化特點(diǎn)不同于相互作用面，不同區(qū)域具有不同結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)

10、育樹，將不同區(qū)域合在一起分析使得相互作用信號被抵消。這個結(jié)果提示我們需要進(jìn)一步分析比較蛋白質(zhì)不同區(qū)域的進(jìn)化特征。 （三）蛋白質(zhì)分子內(nèi)相互作用網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)化分析 通過對PC的（αβ）單體內(nèi)殘基間相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn)，整個相互作用網(wǎng)絡(luò)由多個從內(nèi)層向外層保守性依次降低的子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，部分子網(wǎng)絡(luò)的核心層殘基完全保守，并且對應(yīng)于蛋白已知的功能中心或結(jié)構(gòu)中心。對于PC（αβ）單體來講，它的三個藻膽藍(lán)素（phycocya

11、nobilin，PCB）代表了蛋白的三個功能中心，這三個功能中心分別存在于以PCB為中心的三個保守子網(wǎng)絡(luò)中。PC（αβ）單體內(nèi)亞基間的相互作用面上對亞基的識別和結(jié)合其重要作用的兩個鹽鍵也分別位于兩個保守子網(wǎng)絡(luò)的核心層中。上述結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的功能中心和結(jié)構(gòu)中心以及它們各自的周圍殘基的確形成了由內(nèi)層向外層保守性逐漸降低的子網(wǎng)絡(luò)。本研究利用改進(jìn)的相關(guān)系數(shù)法分析不同功能和/或結(jié)構(gòu)中心之間協(xié)同進(jìn)化，結(jié)果顯示，在21對子網(wǎng)絡(luò)對中，僅有2對在進(jìn)化中

12、存在相互作用。上述結(jié)果表明，整個藻藍(lán)蛋白的進(jìn)化是以區(qū)域（多數(shù)對應(yīng)于功能和結(jié)構(gòu)中心）為單位的，不同區(qū)域具有不同的進(jìn)化特征和進(jìn)化樹。 （四）進(jìn)化過程中分子內(nèi)相互作用的優(yōu)化策略 本論文通過研究適冷酶的適冷進(jìn)化來研究探討蛋白質(zhì)進(jìn)化過程中分子內(nèi)相互作用的優(yōu)化策略。 適冷酶通常由生活于永久低溫環(huán)境（如深海、極地和高山）的生物所產(chǎn)生。適冷酶由于在低溫下具有高的催化效率，因此是近年來生物化學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前對適冷機(jī)制

13、最流行的解釋是適冷酶通過降低熱穩(wěn)定性來提高柔性，而高的柔性則賦予酶高的催化效率。但是，也有報道發(fā)現(xiàn)同時具有高的催化效率和高的熱穩(wěn)定性的適冷酶。因此，深入研究適冷酶催化效率-柔性-穩(wěn)定性三者之間的關(guān)系，闡明酶適冷進(jìn)化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對于適冷酶研究以及生物化學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究具有重要意義。 我們從深海細(xì)菌Pseudoalteromonas sp. SM9913和北極海冰細(xì)菌Pseudoalteromonas sp. SM495中鑒定了屬于

14、thermolysin家族（嗜熱菌素家族，M4）的兩個新的金屬蛋白酶，分別命名為MCP-02和E495。這是thermolysin家族中首次報道生化性質(zhì)的低溫來源的酶。將深海MCP-02和北極E495同來源于陸地細(xì)菌的中溫同源酶pseudolysin進(jìn)行系統(tǒng)的生化和結(jié)構(gòu)性質(zhì)比較，結(jié)果顯示，酶的催化效率和柔性具有相同的順序，都隨來源環(huán)境溫度的降低而升高，為中溫pseudolysin<深海MCP-02<北極E495。但是，酶的熱穩(wěn)定性卻有如

15、下順序：中溫pseudolysin>深海MCP-02≈北極E495。上述柔性和熱穩(wěn)定性的順序上的差異表明，在適冷進(jìn)化過程中，穩(wěn)定性的降低并不是提高柔性所必須的，這與目前流行的適冷機(jī)制不同。 氫鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中最重要的次級鍵，所以很有可能成為蛋白質(zhì)適冷過程中的優(yōu)化對象。對于動態(tài)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，雖然靜態(tài)結(jié)構(gòu)中氫鍵的平均數(shù)目不變，但是動態(tài)結(jié)構(gòu)中氫鍵的組成和平均壽命卻明顯不同。我們使用氫鍵的持續(xù)性（persistency）來表征氫鍵

16、的壽命和穩(wěn)定性，定義為一定時間段內(nèi)，每個氫鍵實(shí)際存在的時間占總時間段的比例。氫鍵持續(xù)性越高，氫鍵壽命越長，越穩(wěn)定；反之，壽命越短，越不穩(wěn)定。 本研究是對深海和北極海冰來源的Thermolysin家族蛋白酶性質(zhì)的首次系統(tǒng)報道，并首次提出了Thermolysin家族蛋白酶的適冷進(jìn)化模型。本研究首次提出優(yōu)化氫鍵動態(tài)持續(xù)性是酶的一項(xiàng)適冷策略，是蛋白質(zhì)適冷進(jìn)化研究的新發(fā)現(xiàn)。本研究首次提出構(gòu)象柔性由鍵（如氫鍵）的持續(xù)性所決定，而不是由蛋白穩(wěn)