反芻家畜MT-Ⅳ基因表達(dá)部位研究及克隆、序列分析.pdf

1、金屬硫蛋白(MTs)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、無脊椎動物和脊椎動物中，因其功能獨(dú)特，近年來對MT各方面的研究也日益受到重視。它能夠清除體內(nèi)自由基防治衰老，增強(qiáng)機(jī)體對不良環(huán)境的適應(yīng)，參與體內(nèi)微量元素代謝，解除重金屬毒性等作用。MT多基因家族至少含有4個(gè)亞型，即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。 本研究在前人對MT-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性引物MT-IVSP1、MT-IV

2、SP2和MT-IVSP3、MT-IVSP4，通過RT-PCR方法從動物組織RNA中擴(kuò)增出了基因編碼區(qū)全序列，通過T4DNA連接酶將目的基因連入載體pGEMR-T Vector的SacⅡ和SpeⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒DNA文庫。再經(jīng)過DNA文庫的篩選、感受態(tài)DHt5a的轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒DNA的提取、限制性酶切以及測序分析后，獲得GenBank各物種登錄號，牦牛(yak)MT-IV(Accession No.：EF141034)，山羊(goat)MT-

3、IV(AccessionNo.：EF470251)和綿羊MT-IV(sheep)(Accession No.：EF624067)，長度均為189bp，從起始密碼子ATG開始到終止密碼子TGA結(jié)束，所以三段序列均為MT-IV序列的編碼區(qū)全長。將各序列在NCBI上進(jìn)行同源性搜索發(fā)現(xiàn)，MTolV核苷酸序列在不同動物中都存在C-X-C、C-X-X-C、C-C-X-C-C保守的三肽結(jié)構(gòu)，說明其在進(jìn)化上十分保守。 本實(shí)驗(yàn)第二階段為對前人所提