牦牛MT-Ⅲ基因cDNA克隆及其核酸與蛋白質(zhì)序列分析.pdf

1、金屬硫蛋白(MTs)是一類低分子量、富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中。MT具有重要的生物學(xué)功能，如重參與金屬解毒、金屬離子穩(wěn)態(tài)的維持、自由基的清除、抗紫外線輻射以及腫瘤等疾病的預(yù)防和治療等。MT家族被分為四種亞型，即MT-Ⅰ、MT-Ⅱ、MT-Ⅲ和MT-Ⅳ。金屬硫蛋白-Ⅲ(MT-Ⅲ)，又稱神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子(GIF)，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等，是金屬硫蛋白家族中的一個(gè)新成員。與其它MT

2、亞型不同，它最早是作為一種生長(zhǎng)抑制因子從神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中被分離出來。因其與MT-Ⅰ/Ⅱ有相似的結(jié)構(gòu)而被命名為MT-Ⅲ。hMT-Ⅲ由68個(gè)氨基酸組成，比hMT-Ⅰ/Ⅱ多7個(gè)氨基酸。MT-Ⅲ與已知的MT-Ⅰ/Ⅱ不同，它具有明確的生理效應(yīng)，這種功能上的差異可能來自于它自身的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。 本研究在前人對(duì)牦牛MT-Ⅰ/Ⅱ研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)MT基因編碼區(qū)同源性高的特點(diǎn)設(shè)計(jì)牦牛MT-Ⅲ基因通用引物YMT-ⅢSP1和YMT-ⅢSP2。然后利用兩

3、引物，采用RT-PCR技術(shù)從牦牛大腦組織總RNA中擴(kuò)增目的DNA片段。在電泳分離目的DNA片段后，通過T4DNA連接酶將目的基因連入克隆載體pGEM(R)-TVector的SacⅡ和SPeⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒DNA文庫。再經(jīng)過DNA文庫的篩選、感受態(tài)E.Coli.JM109的轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒DNA的提取、限制性酶切以及測(cè)序分析后，獲得了牦牛MT-Ⅲ基因cDNA編碼區(qū)序列(GenbankAccessionNo:DQ323545)，長(zhǎng)度為207bp。

4、然后再根據(jù)克隆得到的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)牦牛MT-Ⅲ基因特異引物YMT-ⅢSP3。結(jié)合試劑盒隨帶引物M13Primer4，運(yùn)用3’-RACE方法擴(kuò)增目的DNA片段，經(jīng)與上述相同的克隆操作過程(克隆此片段所用載體是pMD18-TVector)，獲得了牦牛MT-Ⅲ基因cDNA3’末端序列(GenbankAccessionNo：DQ492300)，長(zhǎng)度為378bp。 經(jīng)NCBI同源性搜索發(fā)現(xiàn)克隆得到長(zhǎng)為207bp的編碼區(qū)序列是從起始密碼子A

5、TG開始到終止密碼子TGA，所以是牦牛MT-Ⅲ基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)。該序列在不同哺乳動(dòng)物當(dāng)中同源性很高，其中與牛和綿羊的同源性在95﹪以上，在分子發(fā)育進(jìn)化當(dāng)中十分保守。該基因序列中G/C含量為61.36﹪，且含有多個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)如Eco57MI,PstⅠ等。通過牦牛MT-Ⅲ基因可讀框架(ORF)分析，在長(zhǎng)度為378bp的牦牛MT-Ⅲ基因cDNA3’末端序列中具有一個(gè)完整的閱讀框架，3’末端具有加尾信號(hào)AATAAA和多聚腺苷酸尾巴Poly

6、(A)。 牦牛MT-Ⅲ基因編碼的MT-Ⅲ蛋白由68個(gè)氨基酸組成，其中含有19個(gè)半胱氨酸(Cys)，含量為27.94﹪；既具有與牦牛MT-Ⅰ/Ⅱ相同的保守三肽結(jié)構(gòu)如：C-X-C，C-C-X-C-C，C-X-X-C等，又具有不同于MT-Ⅰ/Ⅱ的T，CPCP等保守結(jié)構(gòu)，共同決定MT-Ⅲ蛋白分子的整個(gè)三維結(jié)構(gòu)，在分子進(jìn)化上十分保守；通過蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析表明：牦牛MT-Ⅲ蛋白質(zhì)沒有明顯的疏水性區(qū)域，也不存在跨膜區(qū)；分子內(nèi)多為無規(guī)則卷曲