中華絨螯蟹表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析及免疫相關(guān)基因的克隆、表達(dá)模式研究.pdf

1、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國(guó)的重要增養(yǎng)殖對(duì)象之一。近年來(lái),隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的提高,由細(xì)菌、病毒和類立克次體生物等引起的各種病害日趨嚴(yán)重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。至今,病害仍然是困擾其養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要因素。除改善環(huán)境因素外,提高機(jī)體自身免疫力和抗病力是解決這一難題的一個(gè)重要方法。本論文試圖從分子角度來(lái)研究中華絨螯蟹的免疫防御機(jī)制,以其為這一重要方法提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。本研究借助分

2、子生物學(xué)和生物信息學(xué)手段,首次完成對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的分析,不僅豐富了中華絨螯蟹的基因數(shù)據(jù),同時(shí)篩選出許多與免疫相關(guān)的基因序列。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)一步對(duì)主要的免疫相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)模式分析,這些研究為了解中華絨螯蟹免疫機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料,同時(shí)也為蟹病的防治提供了新思路。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用常規(guī)cDNA文庫(kù)構(gòu)建

3、技術(shù),成功構(gòu)建了滴度為4.50×10~6CFU/mL,庫(kù)容為3.3×10~6CFU/mL,重組率為73％的中華絨螯蟹血細(xì)胞cDNA文庫(kù);從文庫(kù)中隨機(jī)挑取了3,118個(gè)克隆進(jìn)行5’-端單向測(cè)序,經(jīng)去除低質(zhì)量和污染序列后,共得到3,041條高質(zhì)量EST序列,這些序列的平均長(zhǎng)度為561bp。經(jīng)拼接后獲得了1,049條unique序列,包括292條重疊群(Contig)和757條單一序列(Singleton)。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)有488條Unique

4、序列被注釋成已知的功能基因,551條Unique序列未被注釋任何功能;通過(guò)Gene Ontology功能分類發(fā)現(xiàn)了26個(gè)中華絨螯蟹先天性免疫反應(yīng),如參與酚氧化酶系統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,參與凝集反應(yīng)的谷胱酰胺轉(zhuǎn)移酶,與抗氧化系統(tǒng)相關(guān)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶,抗菌肽類的抗脂多糖因子、甲殼素、以及Osmotin,模式識(shí)別

5、分子類的C-型凝集素、甘露糖結(jié)合蛋白、脂多糖和β-1,3葡聚糖結(jié)合蛋白、Toll受體蛋白。通過(guò)EST表達(dá)豐度分析發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹血細(xì)胞主要免疫相關(guān)基因?yàn)镵azal-型蛋白酶抑制劑和C-型凝集素。
　　2.模式識(shí)別蛋白及其功能的研究是當(dāng)前甲殼動(dòng)物免疫學(xué)的研究重點(diǎn)之一,許多物種的模式識(shí)別蛋白及其功能已經(jīng)明確。本研究根據(jù)EST提供的信息,采用RACE技術(shù)成功克隆了中華絨螯蟹一種模式識(shí)別蛋白-脂多糖和β-1,3葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)基

6、因全長(zhǎng)cDNA序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該序列全長(zhǎng)為1,236bp,包括26 bp的5’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(5’-UTR),1,089 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)和121bp的3’-末端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3’-UTR),共編碼362個(gè)氨基酸,包含一個(gè)由15個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽;蛋白序列與中國(guó)明對(duì)蝦(Penaeus chinensis)、細(xì)角濱對(duì)蝦(Litopenaeus stylirostris),凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vanname

7、i)和淡水螯蝦(Pacifaxtacus leniusculus)LGBP的相似性分別為67%、66%、66%、61%;該基因編碼蛋白含有幾個(gè)保守的區(qū)域,如整合素結(jié)合區(qū),激酶C磷酸化位點(diǎn),N—連接的糖基化位點(diǎn)等,另外還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)水解酶位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,LGBP基因mRNA在中華絨螯蟹肝胰腺、鰓、肌肉、血細(xì)胞、胃和腸中均有表達(dá),其中在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高。用嗜水氣單胞菌進(jìn)行急性感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LGBP在血細(xì)胞中的表達(dá)量在感染后1

8、.5 h達(dá)到最高水平,與對(duì)照組相比存在顯著性差異(P＜0.05),而后表現(xiàn)為下降趨勢(shì),在感染后12 h恢復(fù)到起始水平,說(shuō)明該基因參與了中華絨螯蟹的抗病過(guò)程。
　　3.酚氧化酶原激活酶(PPAF)的活化以及PPAF活化酚氧化物酶原是酚氧化物酶系統(tǒng)行使非特異性免疫功能的關(guān)鍵步驟。本研究成功克隆了中華絨螯蟹PPAF基因全長(zhǎng)cDNA序列。該序列全長(zhǎng)為1,386 bp,其中包括154 bp 5’-UTR,1,134bp ORF和95 bp

9、3’-UTR,編碼378個(gè)氨基酸。該編碼蛋白含有信號(hào)區(qū)域、半胱氨酸折疊區(qū)域和保守的絲氨酸區(qū)域。該。PPAF氨基酸序列與其它無(wú)脊椎動(dòng)物PPAF氨基酸序列相比,具有很高的相似性(55%-75%)。PCR結(jié)果分析表明肝胰腺、肌肉、腸道、鰓中均有PPAF的表達(dá)。嗜水氣單胞菌急性感染后6 h、12 h、48 h,與對(duì)照組相比PPAF基因mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P＜0.05)。結(jié)果表明PPAF與機(jī)體對(duì)外來(lái)病源的防御作用密切相關(guān)。
　　4.

10、作為抗氧化酶類,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)、和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)在清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷等方面起非常重要的作用。本研究在EST序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)RACE技術(shù)獲取了這三種酶基因全長(zhǎng)cDNA序列。其中,SOD基因cDNA全長(zhǎng)為1,339 bp,包括20 bp 5’-UTR,867 bp ORF和452 bp 3’-UTR,共編碼288個(gè)氨基酸,沒(méi)有信號(hào)肽序列,但含有Mn-SOD的

11、標(biāo)記保守序列(DVWHHAYY),說(shuō)明該SOD屬于Mn-SOD。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹Mn-SOD與凡納濱對(duì)蝦(L.vannamei)、班節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、藍(lán)蟹(Callinectes sapidus)和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkia)的Mn-SOD相似性分別為90%、89%、87%、84%和81%。SOD基因在各組織均有表達(dá),

12、其中在血細(xì)胞中表達(dá)量最高,而其他組織中表達(dá)量相對(duì)比較低,結(jié)果提示中華絨螯蟹SOD基因主要在血細(xì)胞中表達(dá)。以嗜水氣單胞菌急性感染中華絨螯蟹,血細(xì)胞SOD基因mRNA的表達(dá)在感染后1.5 h達(dá)到最高,之后開(kāi)始下降并在12 h達(dá)到最低點(diǎn),12 h后表達(dá)量又開(kāi)始升高,至48 h時(shí)表達(dá)量同1.5 h的表達(dá)量基本相同。但是1.5 h、12 h、48 h感染組的表達(dá)量與對(duì)照組之間SOD基因mRNA的表達(dá)水平不存在顯著性差異(P＞0.05)。GPx基因

13、cDNA全長(zhǎng)為1,101 bp,其中包括94 bp 5’-UTR,660 bp ORF和347bp 3’-UTR。該ORF編碼219個(gè)氨基酸,沒(méi)有信號(hào)肽序列。ORF中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)編碼硒半胱氨酸的序列(TGA),說(shuō)明該GPx屬于不含Se的GPx。該序列含有典型的過(guò)氧化物結(jié)構(gòu)域,烷基過(guò)氧化還原蛋白(AhpC)結(jié)構(gòu)域,硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因氨基酸序列與鋸緣青蟹(Scylla serrata)、地中海海綿(Suberites d

14、omuncula)和繁茂膜海綿(Hymeniacidon perlevis)GPx氨基酸序列相似性分別為81%、67%和66%。GPx基因mRNA在各組織均有表達(dá),其中在肝胰腺中表達(dá)量最高,而血細(xì)胞中表達(dá)量相對(duì)比較低。結(jié)果提示中華絨螯蟹的GPx基因主要在肝胰腺中表達(dá)。嗜水氣單胞菌感染中華絨螯蟹不同時(shí)間后,GPx基因mRNA在血細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)作用。在感染后1.5 h,GPx基因mRNA表達(dá)量顯著性低于對(duì)照組(P＜0.05),隨著感染

15、時(shí)間的延長(zhǎng),感染組GPx基因mRNA表達(dá)量雖然有所提高,但仍顯著性低于對(duì)照組。
　　結(jié)果提示,病菌的感染可能抑制了中華絨螯蟹的GPx的表達(dá)。GST基因cDNA全長(zhǎng)為958 bp,包含85 bp 5’-UTR,651 bp ORF和222 bp3’-UTR。該ORF編碼216個(gè)氨基酸,其中含有一個(gè)由17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該蛋白氨基酸序列與赤擬谷盜(Tribolium castaneum)和致倦庫(kù)紋(Culex qu

16、inquefasciatus)GST相似性為53%、與大劣按蚊(Anopheles dirus)和庫(kù)蠓(Culicoides variipennis)GST相似性為52%、與瘧蚊(Anopheles gambiae)GST相似性為51%。該蛋白氨基酸序列含有一個(gè)82個(gè)氨基酸組成的G-位點(diǎn)和126個(gè)氨基酸組成的H-位點(diǎn),另外也含有一個(gè)蛋白酶磷酸化位點(diǎn)和一個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。相似性和系統(tǒng)發(fā)生分析表明該GST屬于delta-GST。通過(guò)實(shí)