日本沼蝦卵巢表達序列標(biāo)簽分析及生殖相關(guān)基因的克隆與表達.pdf

1、生殖細胞的發(fā)生是發(fā)育生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一,卵子在卵巢中的形成更是個體發(fā)育中極其重要的時期,也是歷來備受關(guān)注的生殖生物學(xué)課題。與其它模式生物相比,十足類中關(guān)于生殖的分子機制方面的研究相對薄弱,淡水蝦類尤其突出,迄今對淡水蝦類遺傳資源的了解極為有限,NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的信息量與對蝦類相比頗為匱乏。因此,大量挖掘、獲取淡水蝦類生殖相關(guān)的基因資源,無疑具有重要的意義和潛在的應(yīng)用價值。同時,一些功能保守基因的發(fā)現(xiàn),也為遺傳背景薄弱的經(jīng)濟物種

2、生殖細胞的研究帶來了契機。
　　本文以日本沼蝦為研究對象,通過構(gòu)建卵巢cDNA文庫及表達序列標(biāo)簽分析,鑒別了29個與生殖、發(fā)育相關(guān)的基因;隨后以日本沼蝦卵巢發(fā)育過程為主線,以獲得的表達序列標(biāo)簽為基礎(chǔ),結(jié)合同源克隆策略,分離獲得了7個與卵母細胞形成、成熟有關(guān)的基因,并對其序列特征和時空表達進行了系統(tǒng)地分析。研究主要包括如下四個部分:
　　1、日本沼蝦卵巢cDNA文庫的構(gòu)建及生殖相關(guān)基因的鑒別為了研究日本沼蝦卵巢發(fā)育過程中儲存的

3、遺傳信息,以卵巢為材料構(gòu)建了cDNA文庫,文庫重組率為82.93％,庫容量為2.9×106,插入片段大小為0.5-3kb。隨機挑取文庫中3294個克隆進行5’-3’端測序,獲得了3256條高質(zhì)量的表達序列標(biāo)簽（ESTs）,拼接后得到了1514條單基因簇,其中可推測功能的序列占47.5%。據(jù)序列相似性分析,發(fā)現(xiàn)了組織蛋白酶B和L、細胞周期蛋白B、周期蛋白依賴性激酶、DEAD-box家族蛋白等29個與生殖、發(fā)育相關(guān)的基因。此外,在構(gòu)建的文庫

4、中還發(fā)現(xiàn)了與皮質(zhì)棒形成密切相關(guān)的圍食膜因子,預(yù)測在成熟卵缺少皮質(zhì)棒結(jié)構(gòu)的沼蝦屬種類中,這種基因同樣存在。通過卵巢cDNA文庫的構(gòu)建及ESTs分析,初步明晰了與日本沼蝦卵巢發(fā)育相關(guān)的基因,為進一步研究日本沼蝦乃至十足類的功能基因組提供了重要的基礎(chǔ)資料。
　　2、日本沼蝦DExD-box家族基因的分子克隆、特征分析及時空表達根據(jù)ESTs提供的信息,結(jié)合同源克隆策略,采用RACE技術(shù)成功克隆了以vasa為代表的DExD-box家族4個基

5、因的全長cDNA序列。從日本沼蝦卵巢中克隆得到的DExD-box基因Mn-vasa、Mn-p68和Putative Mn-DDX39 cDNA全長分別為2391、2174和1774bp,開放閱讀框分別為1806、1623和1299bp,編碼601、540和432個氨基酸的蛋白。其中PL10基因的RNA存在選擇性剪接,得到Mn-PL10A、Mn-PL10B兩種轉(zhuǎn)錄本,兩者cDNA全長分別為2277和2649bp,開放閱讀框分別編碼485和

6、709個氨基酸的蛋白,前者比后者在N端缺少224個氨基酸。所推測的5種蛋白均具有DExD-box家族特有的9個保守結(jié)構(gòu)域和GG重復(fù)序列,并且在Q-motif上游17個氨基酸處除Mn-PL10A外都存在一高度保守的苯丙氨酸（F）。RT-PCR的研究結(jié)果表明,Mn-vasa基因僅在日本沼蝦性腺中表達,并且在卵巢發(fā)育的增殖期表達量最高,此后隨著發(fā)育進程逐漸下降,至消退期下調(diào)至最低。除Mn-vasa外,DExD-box家族的另外3個基因Mn-P

7、L10、Mn-p68、Putative Mn-DDX39在日本沼蝦組織中廣泛分布,但都表現(xiàn)出在卵巢和肝胰腺中高表達的特征。它們在卵巢發(fā)育中的表達模式基本相似,都表現(xiàn)為消退期降至最低、次級卵黃發(fā)生期上調(diào)至最高。對日本沼蝦DExD-box家族基因的研究結(jié)果表明,Mn-PL10基因的RNA存在選擇性剪接,推測其屬于通過選擇啟動子形成不同轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接方式;Mn-vasa、Mn-PL10、Mn-p68和PutativeMn-DDX39基因在

8、結(jié)構(gòu)上高度保守,這些保守結(jié)構(gòu)的存在保證了其功能的實施;Mn-vasa基因的主要作用可能體現(xiàn)在卵原細胞的形成上,而Mn-PL10、Mn-p68和Putative Mn-DDX39則可能在日本沼蝦卵母細胞的成熟過程中具有調(diào)節(jié)作用。
　　3、日本沼蝦成熟促進因子（MPF）組成亞基基因的分子克隆、特征分析及時空表達成熟促進因子（MPF）由調(diào)節(jié)亞基周期蛋白B（cyclin B）和催化亞基細胞周期蛋白依賴性激酶(p34cdc2)構(gòu)成。從日本沼

9、蝦卵巢中克隆得到的Mn-cyclin B基因和Mn-Cdc2基因cDNA全長分別為2318和1639bp,開放閱讀框分別編碼398和299個氨基酸的蛋白。Mn-cyclin B具有989bp偏長的3’UTR,其中集中了包括2個多聚腺苷酸加尾信號、5個胞質(zhì)聚腺苷化元件（CPEs）、1個翻譯調(diào)控元件（TCE）和1個K-box在內(nèi)的多種調(diào)節(jié)元件。Mn-cyclin B蛋白具有周期蛋白B特有的破壞框、周期蛋白識別框和磷酸化位點。進一步的多序列比

10、對和同源性分析表明日本沼蝦Mn-cyclin B和斑節(jié)對蝦、日本囊對蝦、鋸緣青蟹、中華絨螯蟹cyclin B的同源性分別為69%、68%、60%和60%,系統(tǒng)進化分析證明Mn-cyclin B基因在進化上高度保守。日本沼蝦周期蛋白依賴性激酶基因高度保守,和斑節(jié)對蝦、鋸緣青蟹、中華絨螯蟹Cdc2的同源性分別為92%、91%和91%;Mn-Cdc2蛋白具有蛋白激酶特有的ATP特異結(jié)合位點、PSTAIR結(jié)構(gòu)域和絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）

11、蛋白激酶活化位點;此外,第14、15和161個氨基酸殘基分別是Thr14、Tyr15和Thr161?？臻g表達的實時熒光定量PCR分析表明,Mn-cyclin B在卵巢中的表達量最高,此外在精巢、肌肉、肝胰腺、表皮和血液中都有較高的表達,而在腸中的表達極其微弱。Mn-Cdc2主要在精巢、卵巢、肝胰腺和表皮內(nèi)表達,其中精巢中的表達量最高,其次是卵巢。時間表達的實時熒光定量PCR分析顯示,Mn-cyclin B轉(zhuǎn)錄本在卵巢的發(fā)育過程中呈現(xiàn)周期

12、性的波動:增殖期Mn-cyclin B基因的表達量處于一相對較高的水平,卵黃發(fā)生前期有所下降,至初級卵黃發(fā)生期開始上調(diào),至成熟期上調(diào)至最高,此后急劇下降。Mn-Cdc2基因的表達量在除次級卵黃發(fā)生期之外的其它各期都基本一致,而在次級卵黃發(fā)生期則有所上調(diào),但與其它各期相比沒有顯著差異。綜合所得的結(jié)果,日本沼蝦cyclin B的翻譯或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程是通過CPEs、TCE和K-box等復(fù)合結(jié)構(gòu)的聯(lián)合作用實施的;Mn-cyclin B和Mn-C

13、dc2蛋白的氨基酸序列高度保守,從結(jié)構(gòu)上保證了其在細胞分裂中調(diào)節(jié)功能的實施,并且直接參與了卵母細胞的減數(shù)分裂,在日本沼蝦卵母細胞的成熟中起著關(guān)鍵的作用。
　　4、日本沼蝦圍食膜因子基因的分子克隆、特征分析及表達模式以日本沼蝦卵巢cDNA文庫中注釋為圍食膜因子（Peritrophin）同源蛋白的EST為基礎(chǔ),采用RACE技術(shù)成功地克隆了日本沼蝦Peritrophin基因全長cDNA序列。該序列全長654bp,包含一個192bp的5’

14、UTR和一個314bp的3’UTR,開放閱讀框長291bp,編碼96個氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)此預(yù)測蛋白具有1個跨膜螺旋,一個CBM 14功能域,含有19個信號肽的裂解位點,具有蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-豆蔻?；稽c和蛋白激酶C磷酸化位點等修飾。RT-PCR的研究結(jié)果表明,Mn-Peritrophin基因在卵巢和肝胰腺中表達量最高,而在雄性生殖腺中的表達則極其微弱;其表達量在日本沼蝦的卵巢發(fā)育中表現(xiàn)出初級卵黃發(fā)生期平穩(wěn)、成熟期高表達的

15、特征。研究結(jié)果提示Mn-Peritrophin基因可能參與了卵母細胞后期成熟過程中卵黃之外的物質(zhì)的積累,和卵母細胞的最終成熟有關(guān);并且Mn-Peritrophin蛋白可能是日本沼蝦皮質(zhì)顆粒的組成成分之一,從而推測日本沼蝦成熟卵母細胞中雖然不含皮質(zhì)棒的結(jié)構(gòu),卻依然存在皮質(zhì)顆粒,并且肝胰腺可能是Mn-Peritrophin蛋白的主要合成位點之一。通過以上研究,鑒別、挖掘了29個與日本沼蝦生殖、發(fā)育相關(guān)的基因,對于日本沼蝦這種遺傳背景相對薄弱

16、而經(jīng)濟價值又較高的淡水蝦類,不僅為其繁殖生物學(xué)在分子水平的研究積累了寶貴的資料,而且為今后進一步開展與生殖相關(guān)的功能基因組的研究奠定了基礎(chǔ)。通過對Mn-vasa基因的克隆和表達特征研究,為其成為日本沼蝦潛在的原始生殖細胞形成的分子標(biāo)記提供了依據(jù)。
　　此外,對日本沼蝦這種卵母細胞中缺乏皮質(zhì)棒結(jié)構(gòu)的真蝦類卻有組成皮質(zhì)棒成分的Peritrophin轉(zhuǎn)錄本存在的發(fā)現(xiàn)及Mn-p68和Mn-DDX39等基因的結(jié)構(gòu)和表達特征的研究,為進一步完

17、善十足類的卵子發(fā)生、繁殖發(fā)育等理論問題提供了更為全面的參考資料。尤其對于DDX39的功能迄今尚未闡明,本研究對Mn-DDX39功能的推測更是為DDX39功能的研究開啟了一扇窗戶,建議今后對DDX39的功能研究可以側(cè)重探討其與配子發(fā)生之間的關(guān)系。綜上所述,本研究為揭示日本沼蝦卵子成熟調(diào)控的分子機制提供了線索,為解決一直困擾著日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的卵巢提前成熟現(xiàn)象提供了基礎(chǔ)資料,也為日本沼蝦的遺傳改良提供了理論依據(jù)。另一方面,以基因庫的形式進行了