Y染色體STR和SNP復合檢測方法的研究.pdf

1、【目的 為提高Y染色體遺傳標記的個人識別能力和非父排除能力，建立Y-STR的復合擴增技術和新一代遺傳標記Y-SNP的檢測方法十分必要。本課題旨在構建九個Y-STR基因座的復合擴增檢測體系，以期為法醫(yī)Y-STR分型提供新的技術手段。建立多重Y-SNP單堿基引物延伸反應，掌握多重單堿基引物延伸反應的一般規(guī)律，為高通量分析Y-SNP提供基礎。方法選定9個Y-STR基因座，應用加尾引物設計策略，構建9個基因座的Y-STR復合擴增熒光檢測體系。依

2、據(jù)DNA分析技術工作組(TWGDAM)指南進行法醫(yī)學可行性研究和群體遺傳學研究。選定3個Y-SNP，設計PCR引物和延伸引物，建立3個Y-SNP的多重單堿基引物延伸反應。利用在完全變性條件下HPLC對DNA片段的分析是按其長度和序列進行分離的原理，建立3個Y-SNP復合檢測方法。并進行法醫(yī)學可行性研究和群體遺傳學研究。結果構建了9個Y-STR基因座：DYS434、GATA-A10、DYS438、DYS439、DYS531、DYS557、

3、DYS448、DYS456，DYS444復合擴增檢測體系(HY-9-plex)。法醫(yī)學可行性研究結果顯示，敏感度檢驗最低模板量HY-9-plex體系為0.5ng；分型結果穩(wěn)定，重復性好，能夠對常見基質上的斑痕正確分型，具有很好的組織同一性、種屬特異性，可以耐受高女性成分的干擾，用于混合斑分析具有優(yōu)勢，可以用于實際檢案。在120個男性樣本中檢出105個單倍型，單倍型變異度為0.9968，標準誤為0002。 成功的建立了M9、M35

4、、M98多重單堿基引物延伸反應。在WAVE核酸片段分析儀上，應用反相離子對變性高效液相色譜法實現(xiàn)了3個Y-SNP的復合檢測。法醫(yī)學可行性研究結果顯示，檢驗最低模板量為0.5ng，分型結果穩(wěn)定，重復性好，對法醫(yī)學常見的生物檢材包括毛發(fā)、血痕、精斑、煙蒂等均獲得明確的實驗結果。在105個男性樣本中檢出四種單倍型，單倍型變異度為0.5104，標準誤為0.014。 結論本研究引入加尾引物設計策略，成功的構建了9個Y-STR基因座的HY-

5、9-plex復合擴增體系。為Y染色體STR鑒別能力的提高提供了一種新的快速、高效及自動化的檢測分析手段。實驗過程中全部采用國產(chǎn)的Taq酶，擴增效率和特異性與進口的Taq酶比較無明顯差異，為試劑國產(chǎn)化進行了有效的探索。 通過建立3個Y-SNP的多重SNuPE反應，揭示單堿基引物延伸反應的關鍵是選擇合適的DNA聚合酶及引物和模板的比例。利用在完全變性條件下HPLC對DNA片段的分析是按其長度和序列進行分離的原理，實現(xiàn)了多重單堿基引物