Y染色體微缺失檢測方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、本研究擬在建立特異性、高通量檢測Y染色體微缺失方法的基礎(chǔ)上再建立檢測AZFb和AZFc區(qū)域重組的方法，為Y染色體微缺失及AZFb、AZFc區(qū)域研究及臨床應(yīng)用提供幫助。 目的:建立改良多重定性PCR方法用于Y染色體微缺失的臨床檢測，該方法比現(xiàn)有的方法采用更多的位點(diǎn)，能分辨不同類型的缺失。對(duì)無精子人群中進(jìn)行檢測，分析不同類型AZF的發(fā)病率。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出5個(gè)能夠準(zhǔn)確代表不同缺失部位的位點(diǎn)，組合成一套實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系。利

2、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)所具有的快速、靈敏、特異等特點(diǎn)，作為Y染色體微缺失的篩查手段。 方法 1)通過NCBI序列數(shù)據(jù)庫找到AZFa-c區(qū)段的DNA序列，挑選出位于a、b、c缺失區(qū)段內(nèi)部及其間隔的22個(gè)位點(diǎn)，整合成5個(gè)改良多重定性PCR體系，使用硼酸鹽緩沖液對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物做快速電泳。分別采用歐洲男科學(xué)會(huì)推薦的多重定性PCR方法和本研究所建立的改良多重定性PCR方法在159例無精子患者中進(jìn)行Y染色體微缺失。將兩種方法獲得的結(jié)果進(jìn)

3、行比較。 2)從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出位于不同區(qū)段的5個(gè)位點(diǎn)，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR．反應(yīng)體系，使5對(duì)引物具有相同的擴(kuò)增效率。對(duì)159例無精子病例采用本方法做Y染色體微缺失檢測，比較改良多重定性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的結(jié)果。 結(jié)論:本研究建立的改良多重定性PCR．方法能夠有效地檢測出Y染色體微缺失并細(xì)分缺失發(fā)生的區(qū)段，而且有潛力檢測出現(xiàn)有方法無法分辨的缺失類型。而實(shí)時(shí)熒光定量PCR還具有更高的靈敏度和特異度，而且操作

4、簡便，適合作為一項(xiàng)初級(jí)篩查手段。 目的：建立Y染色體AZFb、AZFc區(qū)域不同重組類型的引物熒光PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測方法，可以方便快捷且準(zhǔn)確地區(qū)分出幾乎所有的重組類型。采用PCR的方法合成及標(biāo)記AZFc區(qū)域的熒光探針用于熒光原位雜交，作為引物熒光PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳結(jié)果參考的金標(biāo)準(zhǔn)。分析無精子、少精子、反復(fù)流產(chǎn)無因與AZFb+c區(qū)域基因重組的關(guān)系。 方法：使用單拷貝序列PCR的形式針對(duì)red和green重復(fù)單元擴(kuò)增P

5、CR產(chǎn)物作為熒光原位雜交的探針，與Yql2探針同時(shí)雜交分析探針靈敏度和特異度。分析AZFc區(qū)域各重復(fù)單元，從中挑選出具有不同片段長度的同源序列來設(shè)計(jì)引物。引物要求能同時(shí)擴(kuò)增出AZFc區(qū)域內(nèi)同一重復(fù)序列間不同的重復(fù)單元和．AZFc區(qū)域以外的同源重復(fù)序列，同時(shí)這些PCR產(chǎn)物還具有不同的片段長度，可以用3100測序儀區(qū)分其片段大小及不同產(chǎn)物之間的產(chǎn)量比例?？偣苍O(shè)計(jì)4對(duì)引物熒光PCR的引物在PCR反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳，可用于區(qū)分18種AZFb+

6、c區(qū)域內(nèi)的不同重組類型。將引物熒光PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳獲得的結(jié)果與FISH結(jié)果進(jìn)行比較。選取159例無精子癥患者、72例少精子征患者和52例反復(fù)流產(chǎn)無因的病例使用引物熒光PCR結(jié)合細(xì)管電泳做檢測，比較不同病例類型間不同重組類型的發(fā)生率。 結(jié)論：單拷貝序列PCR可用于熒光原位雜交探針的制備，具有低成本、高特異度、通用性廣等優(yōu)點(diǎn)。引物熒光PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳方法可用于AZFb、AZFc區(qū)域各類重組的檢測，具有快速、簡便、高通量的通量