Y染色體新STR基因座的篩選及親權鑒定結果判斷標準的研究.pdf

1、第一部分Y染色體新STR基因座的篩選 1.前言Y染色體是男性特異染色體，除去其兩端約3Mb的區(qū)域可以和X染色體進行重組外，其它區(qū)域不會在減數分裂時和同源染色體發(fā)生重組，叫非重組區(qū)(NRY,non-recombiningregionoftheYchromosome。又稱男性特異區(qū)(MSY，manspecificregionoftheYchromosome)。曾經認為Y染色體除了決定性別外沒有其它作用，現在的研究發(fā)現Y染色體上有許多

2、重要功能基因。由于不會發(fā)生重組，除非發(fā)生突變，一個男性的所有后代均含有同樣的Y-染色體遺傳標記構建的單倍型。這些性質使Y染色體成為研究許多領域的重要工具。Y染色體的遺傳標記有小衛(wèi)星序列(MSY)，微衛(wèi)星序列Microsatellite，MS)，單核苷酸多態(tài)性(SNP)，等。其中的微衛(wèi)星序列，或稱為短串連重復(STR)，是以2-6bp為核心序列的串連重復。它們的多態(tài)性高，片段短，分型容易，還具有男性伴性單倍型遺傳的特點，在法醫(yī)學、進化學、

3、群體遺傳學和醫(yī)學遺傳學等領域都有重要價值。 在法醫(yī)學方面，用Y-STR分析可以進行性犯罪案件中收集到的混合斑的個人識別。用常染色體STR分析可以進行混合斑的個人識別，但是要分離精子和女性的成分，不總是成功。如果男性是輸精管結扎或者無精癥患者，就完全不能用這種方法。在一些檢材，如含多個男性精子，各種體液形成的混合斑(來源于不同性別)等，的鑒定中，Y-STR是很有用的工具。親權鑒定時，如果超過兩代，用常染色體來進行親權鑒定很困難。在

4、這兩種情況下，Y-STR是一種很有用的工具。 Y-STR的研究主要集中在幾個方面。首先是發(fā)現更多的Y-STR基因座，并闡明其基因座特點。由于沒有交換，是單倍型遺傳，所以需要用更多的Y-STR基因座才能得到足夠的信息，比如法醫(yī)學上對個人識別能力和父權排除率的要求。有了更多的Y-STR，排除男系親屬的能力會增加。第二，突變率和突變機制的研究。用突變率可以對人類進化時間進行定量研究。在法醫(yī)學上，有了對突變率和突變機制的深刻了解，可以更

5、準確的解釋結果，下更精確的結論。第三，研究其在不同群體內的基因頻率和單倍型頻率。這是其在各方面，特別是法醫(yī)學方面的應用基礎，由于Y染色體容易受到選擇性清除和遺傳漂變的影響，其基因頻率和單倍型頻率更容易在不同群體間產生差異。因而尋找更多的多態(tài)性高的Y-STR基因座具有重要意義。 為了查找新的Y-STR基因座，用已經完成的Y染色體DNA序列為對象，尋找STR基因座，并對其基因座特點進行研究，同時調查了等位基因頻率和單倍型頻率在漢族人

6、群體中的分布。 2.新Y-STR的查找。在Y染色體的X染色體退化序列(X-degenerate)序列中，選擇AC006989(157666bp)和AC011289(80537bp)作為查找新STR基因座的區(qū)域。用Tandemrepeatsfinder軟件，查找重復單位為3-6bp，完整連續(xù)重復8次以上的微衛(wèi)星。共查到8個符合要求的基因座(AC006989三個，AC0112895個)。在這8個基因座兩端約200bp范圍內設計引物，

7、用降溫(Touchdown)PCR方法進行PCR擴增，產物經銀染后判斷擴增片段長度，確定是否有多態(tài)性。用e-PCR和BLAST等方法在GenBank、Genomedatabase和STRbase查找，確定基因座沒有被報道過。根據這兩個克隆在Y染色體上的位置，將這8個基因座定位于Yq11.221。把有關數據提交到Genomedatabase后，得到基因座名字。 3.新Y-STR的結構特點及和黑猩猩同源序列對比、等位基因的命名。根據

8、國際法醫(yī)遺傳學會推薦的命名原則來命名等位基因。為了使采用其它引物擴增同一基因座時不改變等位基因的名字，把和黑猩猩同源序列相比沒有變化的重復模塊排除在外。 4.8個新Y-STR的等位基因和單倍型頻率在漢族人群體中的分布108個在漢族樣本中，DYS719發(fā)現了4個等位基因，基因多樣性為0.4954；DYS709有5個等位基因，基因多樣性為0.7039；DYS720發(fā)現了11個等位基因，基因多樣性0.8681，它由兩個高度可變的重復模

9、塊組成，使之有最高的基因多樣性。DYS718基因座有5個等位基因，基因多樣性為0.5554；DYS708基因座由5個等位基因，基因多樣性為0.7056；DYS721基因座有4個等位基因，基因多樣性為0.4563；DYS722基因座有5個等位基因，基因多樣性為0.6217；DYS723基因座有5個等位基因，基因多樣性為0.6271?；蚨鄻有院推骄貜痛螖档南嚓P分析顯示在這兩者之間存在正相關(R=0.820，adjustedR2=0.62

10、0，F=12.432，P＜0.02)，提示不只是在一個基因座內，在基因座之間也存在著重復次數越多，越容易產生突變，從而產生較高的基因多樣性這種傾向。 用這8個基因座進行分析，在108個漢族個體內發(fā)現104種單倍型。其中100個單倍型為單一個體，另外4種單倍型分別有兩個個體。單倍型多樣性為0.9989±0.0002，即這8個基因座在法醫(yī)學上的親權否定概率和個人識別能力均為99.89％。主成分分析顯示各基因座之間相關性很小(最高相關

11、系數在DYS719和DYS720之間，相關系數-0.305，P＜0.001)，得到＞85％的信息需要6個主成分。 第二部分親權鑒定結果判斷標準的研究 1前言STR的應用極大地提高了親權鑒定能力，甚至可以在單親(父親或者母親)和孩子之間進行親權鑒定。對一個基因座在法醫(yī)學上應用價值時，其中一個重要參數是非父排除概率(PE，powerofexclusion)，它是基于雙親均在的親權鑒定(簡稱雙親案親權鑒定)計算的，不適合于單親

12、案親權鑒定(既缺父或母的親權鑒定)。研究表明STR基因座的的突變率較高。在出現矛盾基因座時，如何對結果進行判定，在國際法醫(yī)學界還沒有同一的認識(包括單親和雙親親權鑒定)。運用概率學理論，我們計算了單親否定概率，結合有關數據和我室多年的實踐經驗，參考國外相關做法，對親權鑒定時出現矛盾基因座時檢驗以及下結論的策略等問題作一探討。 2單親案親權否定概率PE1和單親鑒定時結果判定策略計算單親案親權否定概率時把孩子為純合子和雜合子分別考慮

13、。設Ai為一個基因座的等位基因，Pi為相應的基因頻率，則在孩子為雜合子AiAj(概率為2PiPj)時，待排男子不含Ai也不含Aj時(機會為(1-Pi-Pj)2)被排除。同樣的道理，孩子為純合子AiAi(P2i)時，待排男子不含Ai(機會為(1-Pi)2)時被排除。各基因座的PE1均低于雙親案親權否定概率(平均0.575)。當單親案親權鑒定出現0、1、2個矛盾基因座時，分別應該檢測15、25、36個基因座才能下肯定的結論。如果出現兩個矛盾

14、基因座，而檢測基因座數量低于17個時，似然率小于0.042，傾向排除親權關系。 3雙親案親權鑒定所需基因座的數目及出現矛盾基因座時結果判定策略根據平均非父排除率和突變率，用二項分布公式分別計算雙親案親權鑒定在檢測9，13，15，17和24個基因座時，真父和隨機男出現0，1，2，3，4個矛盾基因座的概率和似然率。結果顯示如果沒有矛盾基因座出現，檢測9個基因座時似然率為2000，但是非父出現這種情況的概率在也有0.0005；出現1個

15、矛盾基因座，檢測17個STR基因座時，似然率為2.3×103。檢測24個STR基因座，真父和隨機男人出現2個，3個和4個矛盾基因座的似然比分別為1087，1.408和0.002。如果以似然率為1000(相當于父權概率為99.90％)作為判定標準，建議親權鑒定中應該檢測13個以上的STR基因座。出現1個和2個矛盾基因座時，應該分別增加檢測到17和24個基因座，沒有新增矛盾基因座，才能下肯定的結論。檢測到3個矛盾基因座時，應該用其它方法作進

16、一步的分析。出現4個矛盾基因座時，可排除父權關系。 4.討論和傳統(tǒng)的基于蛋白和多糖的遺傳標記相比，DNA遺傳標記在親權關系鑒定中的應用，極大地提高了親權鑒定能力，但是STR的突變率較高(0.02％到0.34％之間，平均0.17％)，在親權鑒定時，常會遇見矛盾基因座，因此出現少量矛盾基因座時，應該如何下結論在國際法醫(yī)學界還沒有同一的認識。由于在單親鑒定時失去了雙親一方的信息，因此應該有不同的判定標準和策略。根據不同情況下的似然率，

17、我們建議在單親案親權鑒定時應該檢驗15個以上的基因座，以3個矛盾基因座為排除結論的界限。如果出現一個矛盾基因座，應該檢測25個基因座，而出現2個矛盾基因座時應該檢測36個以上的基因座。而雙親案親權鑒定，應該檢測13個以上的基因座，以4個矛盾基因座為得出排除親權關系結論的界限。出現一個矛盾基因座時，應該檢測17個以上的基因座，出現2個矛盾基因座時，應該檢測24個以上的基因座。出現3個矛盾基因座時，應該加做基因座或者用其它遺傳標記進一步檢驗