過氧化氫誘導的瑞氏木霉細胞凋亡研究及原生質體細胞活力流式細胞術檢測.pdf

1、瑞氏木霉(TrichDderma reesei，anamorph：Hypocrea jecorina)是一種重要的工業(yè)絲狀真菌，是纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶的主要來源?？勺鳛樗拗鬏d體表達多種外源蛋白質，具有重要的經濟價值。此外瑞氏木霉作為低等多細胞真核生物，具有結構簡單、生長迅速、操作簡便的特點，是真菌遺傳學與細胞生物學研究的理想生物材料。 細胞凋亡(apoptosis)屬于程序性細胞死亡(PCD)，是受到精密調控的

2、細胞自殺過程。在高等動物中，細胞凋亡紊亂可導致多種疾病，如癌癥、艾滋病等。因此細胞凋亡一直是生命科學領域的前沿與熱點，并于2002年獲得諾貝爾獎醫(yī)學獎。目前關于酵母和絲狀真菌的細胞凋亡研究正在成為生命科學新的方向。工業(yè)發(fā)酵過程中，好氧真菌瑞氏木霉時刻暴露于氧化壓力(oxidativestress)下，常導致菌絲死亡，這一過程可能由細胞凋亡引起。 為研究氧化壓力致死機理，本文選擇活性氧物質H2O2模擬氧化壓力。研究表明，低濃度的H

3、2O2可導致瑞氏木霉QM9414原生質體細胞活力發(fā)生可逆性的下降；而較高濃度的H2O2可導致原生質體活力發(fā)生不可逆的下降，直至全部死亡.顯微鏡觀察結果顯示，2.4 mmol/L H2O2處理后的瑞氏木霉菌絲出現細胞質“起泡”及原生質體凝縮等絲狀真菌細胞凋亡的表型特征。Annexin V染色證明PS外翻這一凋亡生化表型。此外，PI染色排除了細胞壞死的可能性。對于動物細胞凋亡中常見的DNA ladder現象，瑞氏木霉與其他大多數真菌中的情況

4、類似，未發(fā)現DNAladder。本文證明細胞凋亡機制在瑞氏木霉細胞中具有保守性。為解釋發(fā)酵過程中的菌體死亡提供了新的思路。 流式細胞術(F1ow cytometry，FCM)是一種基于熒光的細胞生物學分析手段，能快速檢測細胞群體中單個細胞的性質。在動物、植物乃至酵母細胞凋亡研究中有廣泛應用。但由于菌絲形態(tài)的限制，流式細胞術在絲狀真菌中應用有限。對于原生質體的檢測目前尚未見報道。 本文以瑞氏木霉作為研究對象，成功建立了應用

5、流式細胞術檢測絲狀真菌原生質體細胞活力的方法。采用綠色熒光蛋白GFP結合PI的策略檢測了不同濃度H2O2作用后的原生質體活力。其結果與熒光顯微鏡觀察和平板計數結果完全一致。證明流式細胞術是一種有效而準確的原生質體活力鑒定方法。該研究將為絲狀真菌原生質體細胞凋亡檢測提供重要參考。本文證明細胞凋亡機制在瑞氏木霉中具有保守性。2.4mmol/LH2O2可導致瑞氏木霉原生質體細胞凋亡。目前正在嘗試通過轉基因和基因敲除的方法阻斷細胞凋亡信號通路，