腦外傷后Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分:小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的作用
　　目的:
　　本實驗主要目的為檢測TBI后Nrf2和UPS的表達，并進一步觀察在使用UPS抑制劑MG132后小鼠的預(yù)后，探討兩者之間可能的調(diào)控機制。
　　方法:
　　1.實驗動物及分組:使用健康成年雄性ICR小鼠，大小約28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠，大小約28-32g;均有南京軍區(qū)

2、南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。
　　2.小鼠TBI模型的建立:采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。
　　3.藥物的處理:tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1％DMSO中的溶液，按照50mg/kg計算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥。
　　4.標本的取材和制備:致傷24小時后，將小鼠麻醉后，經(jīng)左心室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。
　　5.神經(jīng)功能評分:在TBI后1天，3天采用N

3、SS評分對小鼠進行神經(jīng)功能評分。所得分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。
　　6.測定腦水腫:TBI后24小時，將動物處死，迅速取腦，去除腦干及小腦，獲得傷灶側(cè)皮層組織。
　　7.TUNEL細胞凋亡檢測:采用TUNEL細胞凋亡試劑盒對腦組織石蠟切片(5μm)進行神經(jīng)細胞凋亡對檢測。
　　8.western blot檢測:分別利用12％，10％的凝膠電泳分離核蛋白，漿蛋白，檢測各組核蛋白，漿蛋白中Nrf2的表達。
　　

4、9.免疫組化染色:制作組織切片，利用免疫組化染色方法檢測各組中Nrf2的表達，及Nrf2在細胞內(nèi)的定位情況。
　　10.凝膠電泳遷移實驗:采用EMSA試劑盒對小鼠腦皮層組織進行生物素標記的Nrf2目的DNA的檢測。
　　11.乙醇磷鎢酸電鏡觀察泛素化蛋白:外傷模型后24小時，取各組小鼠的腦組織約1mm3，置于4％戊二醛溶液中固定1小時。
　　12.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差

5、(x±SEM)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.TBI后激活Nrf2表達可以改善神經(jīng)功能，減少腦水腫和抑制神經(jīng)細胞的凋亡。
　　2.TBI激活Nrf2表達可減少異常的泛素化蛋白表達。
　　3.TBI后抑制Nrt2表達可加劇神經(jīng)功能障礙，增加腦水腫，促進神經(jīng)細胞的凋亡。
　　4.TBI后抑制Nrf2表達可增加異常的泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相

6、比，Nrf2(-/-)小鼠在外傷后泛素化蛋白增多(P＜0.05），相對的游離泛素減少(P＜0.05)。
　　5.在Nrt2(+/+)小鼠中使用MG132后可顯著增加泛素化蛋白的表達，并且明顯加劇神經(jīng)細胞的凋亡，而在Nrf2(-/-)小鼠中使用MG132后泛素化蛋白表達沒有明顯改變，并且不影響神經(jīng)細胞的凋亡水平。
　　結(jié)論:
　　1.TBI后激活Nrf2表達引起泛素化蛋白的減少，表明UPS活性增高;TBI后抑制Nrf2表

7、達引起泛素化蛋白的增加，表明UPS活性下降。
　　2.Nrf2可能通過調(diào)控UPS來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　第二部分:小鼠腦外傷模型中Nrf2-ARE通路調(diào)控泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的可能機制
　　目的:
　　本實驗通過激活或抑制Nr2表達來檢測GSH/ROS水平，同時通過激活或抑制GSH/ROS表達來檢測UPS活性的高低，探討Nrf2與UPS之間可能的調(diào)控機制。
　　方法:
　　1.實驗動物及分組:使用健康

8、成年雄性ICR小鼠，大小約28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠，大小約28-32g;均有南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。
　　2.小鼠TBI模型的建立:采用改良的flierl自由落體法制備閉合性小鼠腦損傷模型。
　　3.藥物的處理:tBHQ先配制成濃度為5mg/ml溶于1％DMSO中的溶液，按照50mg/kg計算劑量并于造模前一天經(jīng)腹腔注射給藥。
　　4.標本的取材和制備:致傷24小時后，將小鼠麻醉后，經(jīng)左心

9、室灌注等滲鹽水(4℃)至肝臟發(fā)白后斷頭開顱取腦。
　　5.檢測腦組織中GSH和ROS含量:根據(jù)GSH和ROS檢測試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀進行測量，用Bradford法測定總蛋白。
　　6.免疫熒光化學(xué)檢測:制備組織冰凍切片，利用免疫熒光雙染方法檢測腦組織中ROS的表達以及在神經(jīng)元細胞，細胞核中的分布情況。
　　7.western blot檢測:利用8％凝膠電泳分離總蛋白，檢測總蛋白中泛素化蛋白的表達。
　

10、　8.免疫組織化學(xué)檢測:制作石蠟組織切片，利用免疫組化染色方法檢測泛素化蛋白的表達。
　　9.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SEM)表示。
　　結(jié)果:
　　1.TBI后使用tBHQ可以引起GSH含量增高，ROS表達強度下降。與單純外傷相比，TBI后使用tBHQ可以明顯增高GSH表達含量(P＜0.05)，而且ROS表達強度明顯變?nèi)?P＜0.0001)。
　　2.TBI

11、后Nrf2(-/-)小鼠中GSH含量降低，ROS表達強度增高。與單純外傷組相比，TBI后Nrf2(-/-)小鼠中GSH表達含量明顯降低(P＜0.05)，ROS表達強度明顯增高(P＜0.0001)。
　　3.TBI后激活ROS表達強度后，GSH的含量顯著下降，泛素化蛋白表達明顯增多。與單純外傷組相比，使用FAC刺激ROS生成后(P＜0.0001)，出現(xiàn)GSH含量的下降(P＜0.05)，和泛素化蛋白的增多(P＜0.01)。
　　

12、4.TBI后抑制ROS表達強度后，GSH的含量，泛素化蛋白的表達明顯減少。與單純外傷組相比，使用NAC抑制ROS生成后(P＜0.0001)，出現(xiàn)GSH含量的升高(P＜0.05)，和泛素化蛋白的減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.TBI后激活表達Nrf2，可以增加GSH含量，同時減少ROS表達強度;TBI后抑制表達Nrf2，可以明顯減少GSH含量，同時顯著增強ROS表達強度。
　　2.TBI后激活表達ROS，可以

13、使GSH的含量顯著下降，泛素化蛋白表達明顯增多，UPS活性下降;TBI后抑制表達ROS，可以使GSH的含量顯著增高，泛素化蛋白表達明顯減少，UPS活性增高。
　　3.Nrf2通過氧化還原平衡(GSH/ROS)來調(diào)控UPS的活性。
　　第三部分:神經(jīng)元TBI模型中Nrf2-ARE通路對泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的作用
　　目的:
　　在體外環(huán)境中驗證Nrf2，氧化還原平衡，UPS三者之間的關(guān)系。
　　方法:

14、
　　1.神經(jīng)元的培養(yǎng):選取孕17-19天的成年雌性ICR及Nrf2(-/-)小鼠，斷頸處死后，放入酒精中消毒。
　　2.神經(jīng)元的分組及外傷模型:培養(yǎng)成熟后的ICR神經(jīng)元隨即分為:對照組，外傷組，外傷+tBHQ組，外傷+FAC組，外傷+NAC組。
　　3.藥物的處理:用培養(yǎng)基配制tBHQ至最終濃度為10uM，于TBI前2小時加入六孔板中，每孔加入2ml。
　　4.western blot檢測:分別利用12％，10

15、％的凝膠電泳分離核蛋白，漿蛋白，檢測各組核蛋白。
　　5.實時熒光定量PCR:按照試劑盒說明，進行目標基因Nrf2的qPCR檢測。
　　6.活性氧的熒光檢測:按照試劑盒說明進行操作，先原位裝載探針，孵育20分鐘后清洗3遍。
　　7.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±SEM)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　

16、　1.神經(jīng)元TBI模型后激活Nrf2的表達可以有效促進Nrf2的核轉(zhuǎn)移，同時減弱ROS的表達。使用tBHQ激活Nrf2的表達，與單純外傷組相比發(fā)現(xiàn)TBI后Nrf2的核轉(zhuǎn)移增加(P＜0.05)，同時ROS的熒光強度變?nèi)?P＜0.001)。
　　2.神經(jīng)元TBI模型后抑制Nrf2的表達可以有限降低Nrf2的核轉(zhuǎn)移，同時ROS的表達增強。使用Nrf2(-/-)孕鼠培養(yǎng)成熟的神經(jīng)元中Nrf2含量顯著降低(P＜0.05)，與單純外傷組相比T

17、BI后Nrf2核轉(zhuǎn)移減少(P＜0.001)，同時ROS的表達強度明顯增強(P＜0.01)。
　　3.神經(jīng)元TBI模型后激活ROS的表達可以增加泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相比，使用FAC可以顯著激活ROS的表達(P＜0.01)，同時發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白增多(P＜0.01)。
　　4.神經(jīng)元TBI模型后抑制ROS的表達可以減少泛素化蛋白的表達。與單純外傷組相比，使用NAC可以顯著抑制ROS的表達(P＜0.001)，同時發(fā)現(xiàn)泛素化蛋