砷誘導皮膚角化紊亂中Nrf2-ARE信號通路的作用及差異蛋白研究.pdf

1、目的：本研究通過體內、體外實驗對家兔及人角質形成細胞染砷，了解砷在皮膚角質形成細胞和皮膚組織中的代謝規(guī)律及內暴露劑量，觀察砷對皮膚角質形成細胞和皮膚組織的影響，探討 Nrf2-ARE信號通路在砷誘導皮膚角化紊亂中的作用及砷氧化損傷的皮膚毒性機制；通過對砷誘導皮膚角化紊亂差異蛋白的研究，在蛋白質分子水平探討砷致皮膚角化紊亂的機制并尋找敏感標記物。為砷性皮膚損傷的防治提供新的思路及科學依據(jù)。
　　方法：⑴采用MTT還原法檢測HacaT

2、細胞生長情況，確定亞砷酸鈉的LC50及染毒濃度，染毒濃度分別為24h LC50的1/50、1/20、1/10，即1.30μmol/L、3.25μmol/L、和6.50μmol/L；觀察時間為24h、48h、72h；⑵流式細胞儀檢測HacaT細胞的凋亡情況；⑶將30只健康成年清潔級雄性家兔隨機分為5組，每組6只，分別為對照組（去離子水）及亞砷酸鈉染毒組。采用自由飲水方式連續(xù)染毒12周。染毒劑量分別為LD50的1/100、1/50、1/20

3、、1/10，即L：0.13mg/千克體重（kg.w）、M：0.26mg/（kg.w）、MH：0.65mg/（kg.w）和H：1.30mg/（kg.w）；⑷染毒12周結束后，家兔背部同一部位皮膚取樣，電鏡下觀察皮膚細胞及組織的形態(tài)學改變；⑸采集家兔處死前24h尿樣，并取家兔肝臟組織，采用高效液相色譜-氫化物發(fā)生原子熒光光譜（HPLC-HGAFS）法檢測家兔尿、肝臟、皮膚的iAsⅢ、iAsⅤ、一甲基胂酸（Monomethylarsonic

4、acid，MMA）和二甲基胂酸（Dimethylarsinic acid，DMA）含量；⑹通過實時熒光定量PCR（Real-time polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測染砷HacaT細胞和家兔皮膚Nrf2 mRNA的表達水平；⑺通過相應試劑盒方法檢測染砷家兔皮膚CAT、8-OHdG、MPO、GSH-Px、GST、SOD和MDA及HO-1含量或活力，總蛋白采用BCA法檢測；⑻用雙向凝膠電泳（two-d

5、imensional gel electrophoresis，2-DE）篩選砷誘導角化紊亂家兔皮膚的差異蛋白點，膠內酶切后，利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）結合NCBI（nr）非冗余數(shù)據(jù)庫檢索對差異蛋白進行鑒定；⑼用RT-PCR檢測 HacaT細胞CK1

6、、CK10和家兔皮膚CK1、CK10、CK2及蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）mRNA的表達水平。
　　結果：①1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒48h能顯著促進HacaT細胞增殖；3.25μmol/L亞砷酸鈉染毒96h、6.25μmol/L亞砷酸鈉染毒72h顯著抑制HacaT細胞增殖（P均＜0.05）；②1.30μmol/L亞砷酸鈉能抑制HacaT細胞凋亡，24h時凋亡率最低；3

7、.25μmol/L、6.25μmol/L亞砷酸鈉染毒48h、72h可使HacaT細胞凋亡率逐漸升高（P均＜0.05）；③電鏡下可見，和對照組相比各染毒組家兔皮膚細胞形態(tài)和表皮尤其是皮膚角質層結構發(fā)生了改變。0.13mg/（kg.w）砷染毒12周即可出現(xiàn)角化紊亂，隨砷染毒劑量的升高，家兔皮膚細胞形態(tài)改變及角化紊亂程度加重；④染毒12周后家兔尿中總砷、iAsⅢ及DMA含量水平隨砷染毒劑量的升高呈逐漸升高的趨勢，與對照組比較，H砷染毒劑量組總

8、砷、iAsⅢ及DMA含量水平升高（P均＜0.05）。iAsⅤ含量水平無明顯變化趨勢。MMA含量水平隨砷染毒劑量升高呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，與對照組比較，MH及H砷染毒劑量組其含量水平升高（P＜0.05）。與對照組比較，各砷染毒劑量組PMI值均升高（P＜0.05）。與對照組比較，除L砷染毒劑量組外，其余砷染毒劑量組SMI值均升高（P＜0.05）；各染毒組家兔皮膚總砷及 DMA含量高于對照組，且隨染毒劑量升高而升高（P＜0.05）；各形態(tài)砷中，

9、DMA含量最高。iAsⅢ含量除MH組外，各染毒組高于對照組；iAsⅤ含量各組均高于對照組，MMA含量L組和H低于對照組，MH組高于對照組（P均＜0.05）。兔肝臟中總砷含量水平隨砷染毒劑量的升高呈逐漸升高的趨勢，與對照組比較，M、MH、H砷染毒劑量組總砷含量水平升高（P＜0.05）。肝臟中iAsⅢ含量在各組間沒有統(tǒng)計學差異；肝臟中 iAsⅤ含量 M組與其他組相比升高（P＜0.05）。肝臟中 MMA含量在各組間沒有統(tǒng)計學差異；肝臟中 DM

10、A含量在各組中不同，與對照組相比，MH和H染砷劑量組其含量升高（P＜0.05）。家兔皮膚和尿中砷以DMA形態(tài)為主，肝臟中各種形態(tài)砷分布未發(fā)現(xiàn)規(guī)律；隨著砷染毒劑量升高，皮膚DMA所占比例有升高的趨勢。皮膚和尿的總砷和DMA含量與肝臟總砷和DMA含量呈正相關；⑤亞砷酸鈉染毒能使HacaT細胞Nrf2 mRNA表達發(fā)生改變，1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒使mRNA表達上調，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加使mRNA表達逐漸下調（P＜0.05）

11、。砷染毒48h后HacaT細胞Nrf2 mRNA表達水平與細胞活性呈正相關關系；L、M組家兔皮膚Nrf2 mRNA的表達上調；MH、H組皮膚Nrf2 mRNA的表達下調，其中L、H組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。⑥染砷家兔皮膚8-OHdG在H組，MDA在MH和H組比對照升高（P＜0.05）；CAT和HO-1在M、MH和H組，GSH-Px在H組比對照降低（P＜0.05）；GST在H組比對照升高（P＜0.05）；SOD和MP

12、O在各組無明顯差異。染砷家兔皮膚Nrf2 mRNA表達與HO-1、GSH-Px水平呈正相關關系，與MDA、8-OHdG水平呈負相關關系；⑦2-DE電泳蛋白斑點清晰可見，各組蛋白斑點數(shù)在100-200之間，其中對照組蛋白斑點數(shù)為119，而其余4組蛋白斑點均為129個并全部匹配。對照組和其余各組的蛋白斑點匹配率為92.24％。與對照相比差異表達的蛋白點有45個，鑒定出20種差異蛋白。其中細胞角蛋白Ⅱ型蛋白、GST-P和PDI可能與砷的皮膚毒

13、性有關；⑧細胞角蛋白Ⅱ型蛋白在各砷染毒組家兔皮膚表達，而在對照組中無表達；HacaT染砷后CK1、CK10 mRNA表達發(fā)生改變，1.30μmol/L亞砷酸鈉染毒能使mRNA表達上調，隨著染毒時間延長、染毒濃度增加mRNA表達逐漸下調（P＜0.05）；染砷家兔皮膚CK1、CK2、CK10 mRNA在L組表達上調，H組表達下降至正常或下調（P＜0.05）。染砷家兔皮膚PDI蛋白表達量隨染砷劑量升高而先下調后上調；PDI mRNA在MH和H

14、組，隨染砷劑量升高表達量上升（P＜0.05）。
　　結論：亞砷酸鈉可在動物角質形成細胞和皮膚組織中發(fā)生生物轉化并形成一系列代謝產(chǎn)物，隨染毒劑量增加，皮膚砷負荷增加，可致皮膚氧化損傷，并引起角質形成細胞和皮膚組織 Nrf2表達變化，并隨染毒時間和濃度變化呈雙向性；砷通過調控Nrf2水平繼而影響皮膚角質形成細胞的增殖和凋亡及皮膚組織Nrf2-ARE信號通道下游酶的改變，皮膚氧化-抗氧化平衡被破壞，出現(xiàn)角化紊亂等形態(tài)學改變。砷代謝及Nr