Nrf2-ARE通路對(duì)異煙肼致小鼠肝臟損傷作用的研究.pdf

1、目的：研究異煙肼（INH）導(dǎo)致小鼠肝臟損傷發(fā)生過(guò)程中，核因子相關(guān)因子2（Nrf2）及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）在組織中的表達(dá)情況，探討Nrf2-ARE通路在INH致小鼠肝損傷中的作用，明確其在肝損傷發(fā)生過(guò)程中對(duì)Ⅱ相藥物解毒和抗氧化損傷的影響。
　　方法：SPF級(jí)昆明小鼠112只，采用隨機(jī)分組法分為14組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組分為異煙肼90mg/kg灌胃1d、3d、5d、7d、2周、3周、4周組，對(duì)照組在相

2、同時(shí)間點(diǎn)給予等體積蒸餾水灌胃處理。末次給藥后采用摘眼球取血法收集小鼠血液，頸椎脫臼法處死小鼠取肝組織。全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）含量；比色法檢測(cè)肝組織中還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量，GST和SOD酶活力；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)肝組織中 Nrf2、GST和SOD蛋白含量；SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測(cè)肝組織中N

3、rf2、GST、SOD mRNA表達(dá)水平；免疫組織化學(xué)法觀察Nrf2蛋白跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況。
　　結(jié)果：首先對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物一般情況進(jìn)行觀察，對(duì)照組小鼠皮毛光澤正常，自主活動(dòng)多；實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)食減少，皮毛蓬松無(wú)光澤，易脫毛，自主活動(dòng)減少。動(dòng)物稱(chēng)重后發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組小鼠體重均逐漸增加，僅在第4周時(shí)，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重低于對(duì)照組（t=3.780，P=0.002）。其次進(jìn)行了組織病理學(xué)觀察和常用肝功能指標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示，用藥3d

4、時(shí)的組織切片可見(jiàn)細(xì)胞腫脹等病理改變，4周時(shí)可見(jiàn)雙核細(xì)胞增多，肝細(xì)胞再生，用藥5d、7d時(shí)動(dòng)物肝臟指數(shù)高于對(duì)照組（F=9.635，P<0.001）；而實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中 ALT含量在用藥2周時(shí)才開(kāi)始升高（F=13.425，P<0.001），AST含量在4周時(shí)升高（F=3.498，P=0.004），提示肝功能指標(biāo)不能及時(shí)反映肝細(xì)胞損傷。第三，分析了肝細(xì)胞損傷、肝組織Ⅱ相藥物代謝能力以及抗氧化應(yīng)激能力指標(biāo)的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中

5、MDA含量隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，在7d時(shí)達(dá)到高峰，在隨后的2周、3周、4周時(shí)間內(nèi)卻有所下降（F=3.816，P=0.002）；而GSH含量在用藥7d時(shí)處于谷底，在4周時(shí)回升至正常水平（F=11.869，P<0.001）；GST、SOD酶活力在給藥2周時(shí)間內(nèi)逐漸下降，隨后在用藥3周、4周時(shí)又逐漸回升至正常水平（F=3.365，P=0.005；F=3.769，P=0.002）。第四，分析了肝組織中 Nrf2蛋白的跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)情況。免疫組

6、化檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，對(duì)照組小鼠肝組織中 Nrf2蛋白主要在胞漿中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組從用藥7d開(kāi)始可見(jiàn)Nrf2進(jìn)入胞核表達(dá)，且胞核陽(yáng)性表達(dá)量隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加（F=161.477，P<0.001），其變化特征與 GST、SOD酶活力和MDA及GSH含量在2周前的變化是同步的，提示肝組織中Nrf2蛋白隨著肝細(xì)胞損傷的發(fā)生而出現(xiàn)跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)，且兩者呈正相關(guān)。第五，分析了Nrf2-ARE通路下游相關(guān)指標(biāo)的mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著GS

7、TA1、GSTM1、Cu-ZnSOD和MnSOD四項(xiàng)指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，其對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)也相應(yīng)的呈上調(diào)趨勢(shì)，呈現(xiàn)出明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。Nrf2蛋白在用藥7d開(kāi)始發(fā)生跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)后，GSTA1在2周、3周、4周時(shí) mRNA表達(dá)上調(diào)（F=9.375，P<0.001）；蛋白含量雖然在用藥2周時(shí)達(dá)到最低，但在3周、4周時(shí)蛋白含量較2周有所升高（F=10.157，P<0.001）。GSTM1在也在隨后的3周、4周 mRNA出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（F=3

8、.259，P=0.005）；蛋白含量在2周時(shí)低于對(duì)照組（F=6.374，P<0.001），但在3周、4周均處于正常水平。同時(shí)可見(jiàn)GST酶活力在3周、4周時(shí)上升至正常水平。該分析結(jié)果提示 Nrf2跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)后，上調(diào)了 GST基因以及蛋白的表達(dá)，GST酶活力增加，增強(qiáng)肝臟Ⅱ相藥物解毒能力。Cu-ZnSOD和MnSOD mRNA也是在3周時(shí)出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（F=8.261，P<0.001；F=4.026，P=0.002）；蛋白含量雖然在2周時(shí)達(dá)到