家蠅幼蟲免疫刺激前后差異蛋白質(zhì)組及差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、家蠅(Musca domestica)從幼蟲到成蟲均生活在雜菌橫生的環(huán)境里，其體表帶有多種病原菌，可以傳播多種疾病。據(jù)報(bào)道約有100多個(gè)可引起人類和動(dòng)物疾病的病原體與家蠅有關(guān)，包括傷寒、霍亂、桿菌性痢疾、肺結(jié)核、炭疽熱、嬰兒腹瀉和一些寄生蟲病等。雖然家蠅沒(méi)有脊椎動(dòng)物那樣高度專一的免疫系統(tǒng)，但是在細(xì)菌感染或者其它物理、化學(xué)因子的誘導(dǎo)下，其體內(nèi)可以快速生成免疫活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)主要包括多種抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶等。研究表明，家蠅體內(nèi)的

2、活性物質(zhì)不僅對(duì)多種病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲具有殺傷和抑制作用，同時(shí)對(duì)多種癌細(xì)胞也具有殺傷和抑制作用，但是大部分對(duì)人體是比較安全的。昆蟲體內(nèi)活性物質(zhì)的抗菌、抗癌作用是無(wú)脊椎動(dòng)物先天免疫研究的熱點(diǎn)之一。目前這些研究主要集中在果蠅(Drosophila melanogaster)、岡比亞按蚊(Anopheles gambiae)棕尾別麻蠅(Boettcherisca peregrinas)等中，已經(jīng)分離出了多種具有抗菌和抗癌作用的抗菌肽及其它

3、活性物質(zhì)。在家蠅中的相關(guān)研究相對(duì)較少。因此，對(duì)家蠅的免疫系統(tǒng)的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 本研究利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究分析了家蠅幼蟲血淋巴在細(xì)菌刺激前后蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。除了在昆蟲中已報(bào)道的免疫反應(yīng)蛋白，還確定了幾種新的參與免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。本研究還利用抑制性消減雜交的方法構(gòu)建了家蠅cDNA消減文庫(kù)，得到數(shù)個(gè)免疫相關(guān)基因和氧化還原酶系相關(guān)基因。為進(jìn)一步克隆家蠅免疫相關(guān)基因提供了有價(jià)值的信息。然后通過(guò)同源克隆的方法從

4、家蠅幼蟲體內(nèi)克隆得到了銅/鋅超氧化物歧化酶基因，分析了它在細(xì)菌刺激不同時(shí)間后的轉(zhuǎn)錄模式，并通過(guò)原核表達(dá)的重組蛋白制備了家兔多克隆抗體，研究了該蛋白在不同組織中翻譯模式，最后檢測(cè)了該蛋白的活性。同時(shí)，通過(guò)RT-PCR方法分析了另一個(gè)免疫相關(guān)的泛素融合蛋白基因的轉(zhuǎn)錄模式，并通過(guò)原核表達(dá)獲得了純化的泛素融合蛋白，擬進(jìn)一步分析其性質(zhì)。這些研究使我們對(duì)家蠅的先天免疫反應(yīng)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，為了解家蠅獨(dú)特的免疫防御機(jī)制提供了理論依據(jù)。 本研究

5、取得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析了細(xì)菌免疫刺激后家蠅幼蟲血淋巴中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌免疫家蠅幼蟲后，用雙向凝膠電泳的方法來(lái)檢測(cè)血淋巴中蛋白質(zhì)表達(dá)。在雙向電泳圖譜中共檢測(cè)到350個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，288個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在免疫刺激前后沒(méi)發(fā)生變化，11個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)免疫刺激后上調(diào)，37個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)免疫刺激后下調(diào)，14個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)只在免疫刺激后幼蟲血淋巴樣品中能檢測(cè)到。MALDI-TOF-M

6、S共鑒定了35個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括7個(gè)免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)，如革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白1，肽聚糖識(shí)別蛋白LF，核因子NF-kB p110亞基和溶菌酶X。除了在昆蟲中已報(bào)道的免疫反應(yīng)蛋白，還確定了幾種新的可能與免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，包括類DCN1樣蛋白和cAMP依賴的蛋白激酶。另外還有一些參與解毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)也被鑒定出來(lái)，如超氧化物歧化酶，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，細(xì)胞色素P450等。RT-PCR分析了溶菌酶X，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和超氧化物歧化酶在mR

7、NA水平上的變化，結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)在細(xì)菌刺激之后轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)變化與翻譯水平的變化是基本一致的的。上述結(jié)果表明，這些蛋白質(zhì)可能參與了家蠅的先天免疫反應(yīng)，為了解家蠅獨(dú)特的免疫防御機(jī)制提供了理論依據(jù)。 2.應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建家蠅幼蟲差異表達(dá)cDNA消減文庫(kù)。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌液刺激的家蠅三齡幼蟲與未刺激的同齡家蠅幼蟲為消減雜交對(duì)象，分別提取mRNA，合成cDNA，刺激的為測(cè)試子(tester)，不刺激的為驅(qū)趕子(d

8、river)，經(jīng)兩次消減雜交及兩次抑制性PCR后就分離出測(cè)試子中差異表達(dá)cDNA片段，將差異表達(dá)cDNA片段與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得cDNA消減文庫(kù)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR篩選部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序及GenBank BLASTx分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)cDNA片段大部分分布于200-750bp之間，并篩選出數(shù)個(gè)免疫相關(guān)基因和氧化還原酶系相關(guān)基因的EST，如防御素基因、細(xì)胞色素氧化酶基因、溶菌酶基因、絲氨酸蛋白酶基因、過(guò)氧化氫酶基因、氧

9、化還原酶基因，Dicer等。從而為家蠅免疫相關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。 3.根據(jù)GenBank上檢索的Cu/Zn SOD mRNA序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物克隆得到基因全長(zhǎng)。Cu/Zn SOD基因全長(zhǎng)為734bp，包含462bp的開放閱讀框。基因的5’端含有9bp的非編碼區(qū)，3’端含有263bp的非編碼區(qū)，同時(shí)還有一個(gè)17 bppolyA尾巴。這一基因編碼的蛋白質(zhì)由153個(gè)氨基酸構(gòu)成。蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SMART預(yù)測(cè)，其中包含一個(gè)為Sod_

10、Cu結(jié)構(gòu)域，沒(méi)有信號(hào)肽，預(yù)測(cè)分子量為15.6kDa，理論等電點(diǎn)為5.67。 為了進(jìn)一步確認(rèn)家蠅幼蟲Cu/Zn SOD基因的轉(zhuǎn)錄模式，還利用RT-PCR的方法研究了在混合菌刺激后不同時(shí)間段這一基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示在細(xì)菌刺激后3h，Cu/Zn SOD表達(dá)開始增加，6h時(shí)增至最高值，至12h又有明顯的下降。這一變化趨勢(shì)說(shuō)明在家蠅幼蟲受到外界刺激后Cu/Zn SOD基因上調(diào)表達(dá)。這一結(jié)果與家蠅幼蟲血淋巴的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析所得到的結(jié)

11、果一致。根據(jù)Cu/Zn SOD基因序列設(shè)計(jì)表達(dá)引物，將基因片段克隆到pGEX-4T-1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白在上清中，沒(méi)有形成包涵體，用Glutathione Sepharose 4B親和柱直接進(jìn)行純化。利用重組表達(dá)并純化的Cu/Zn SOD作為抗原免疫家兔，制備多克隆抗體。 利用SOD多克隆抗體研究了SOD蛋白在不同組織中的表達(dá)模式。將細(xì)菌刺激前后家蠅血淋巴、中腸、脂肪體蛋白進(jìn)行SD

12、S-PAGE并轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜后，用SOD抗血清作為一抗，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，天然的SOD蛋白主要存在于中腸和脂肪體中，在血淋巴也有較弱的表達(dá)。細(xì)菌刺激之后，在各組織中的表達(dá)都上調(diào)，但是在血淋巴中的上調(diào)較微弱。 10％非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行酶的活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu/Zn SOD活性在IPTG誘導(dǎo)3h以后，顯示出明顯的酶活性條帶，純化的Cu/Zn SOD也

13、具有明顯的酶活性條帶。誘導(dǎo)前也有較弱的活性，可能轉(zhuǎn)化菌株存在少量滲漏表達(dá)。 4.本研究還對(duì)家蠅泛素融合基因(Mubs27)在細(xì)菌刺激之后的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并進(jìn)行了重組表達(dá)研究，擬進(jìn)一步分析其性質(zhì)。RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌刺激家蠅幼蟲之后Mubs27表達(dá)上調(diào)。通過(guò)蛋白質(zhì)組分析在家蠅體內(nèi)鑒定出了免疫相關(guān)蛋白NF-κB，它在細(xì)菌免疫之后誘導(dǎo)表達(dá)。Mubs27可能在激活NF-κB的過(guò)程中起了重要的作用，而NF-