干預(yù)腦出血術(shù)后鐵超載的角蛋白凝膠構(gòu)建及性能研究.pdf

1、腦出血是致殘率和致死率較高的疾病，嚴(yán)重威脅著人類健康。腦出血發(fā)生后會(huì)在腦組織內(nèi)形成血腫，誘發(fā)原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷。對(duì)于出血量較大的腦出血患者（>30mL），首選治療方式為手術(shù)治療，通過手術(shù)清除血腫，可降低顱內(nèi)壓，減輕或者避免血腫對(duì)神經(jīng)組織的壓迫。但目前無論采取何種入顱手術(shù)，在臨床上都無法將血腫完全清除。殘留血腫內(nèi)紅細(xì)胞裂解后會(huì)釋放出大量血紅蛋白，經(jīng)血紅素降解，產(chǎn)生一氧化碳、鐵離子和膽紅素等物質(zhì)，進(jìn)而誘發(fā)繼發(fā)性腦損傷。其中，鐵離子作為紅細(xì)

2、胞主要的降解產(chǎn)物，會(huì)大量聚集于腦組織，呈現(xiàn)過載現(xiàn)象，過載的鐵離子催化過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生自由基，進(jìn)而攻擊細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸，造成細(xì)胞死亡。因此，通過干預(yù)腦出血術(shù)后鐵超載有望提高其治療效果。
　　本課題基于影響腦出血手術(shù)治療效果的術(shù)后鐵超載，構(gòu)建了載鐵離子螯合劑的角蛋白凝膠作為術(shù)后的原位治療藥物。該凝膠在血腫清除手術(shù)后植入腦內(nèi)，不僅可以通過凝膠吸附作用快速吸附殘留血腫組織周圍的過載鐵離子，還可以釋放包埋的藥物對(duì)鐵離子進(jìn)行螯合，從而通過消除

3、鐵超載，緩解腦出血術(shù)后的繼發(fā)性腦損傷，可為腦出血的輔助性治療提供一種新的治療理念和策略。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容和相應(yīng)結(jié)果如下：
　　①采用氧化法從人頭發(fā)中提取氧化型角蛋白，作為藥物載體的原材料。得到人頭發(fā)角蛋白提取率為3.52±0.56％。應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)角蛋白的分子量進(jìn)行分析，得頭發(fā)角蛋白多肽片段主要分為兩部分，一部分大量聚集于40-60KD，主要為α角蛋白，另一部分少量聚集于10-15KD處，主要為γ

4、角蛋白，根據(jù)電泳結(jié)果可知，該角蛋白混合物以α角蛋白為主。應(yīng)用氨基酸分析儀對(duì)角蛋白進(jìn)行了氨基酸分析，所得角蛋白中一共被檢測(cè)出17種氨基酸，總含量占角蛋白總質(zhì)量的64.50±4.08%，除色氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺之外，所有氨基酸均被檢測(cè)到，含量最高的為谷氨酸和精氨酸，分別占角蛋白質(zhì)量的11.08±1.15%和7.01±0.57%，含量最低的為蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸以及賴氨酸，含量分別占0.61±0.15%，1.03±0.06%，1.68

5、±0.14%和1.93±0.41%。組成角蛋白的氨基酸中二硫鍵含量較低，所含極性親水性氨基酸較多，表明角蛋白具有較高的親水性。
　?、诓捎梦锢斫宦?lián)法制備了空白角蛋白凝膠，并通過其鐵離子吸附性能考察了角蛋白凝膠濃度對(duì)鐵離子吸附性能的影響，得出結(jié)論為：濃度為30%的角蛋白凝膠具有最佳的鐵離子吸附能力。前120min吸附最快，鐵離子清除率達(dá)到27.47±1.71%，120-360min時(shí)間內(nèi)，鐵離子濃度下降較為平緩，凝膠的吸附率為4.6

6、4±0.49μg/mg，360min以后，鐵離子濃度和凝膠吸附率皆趨于穩(wěn)定。接著對(duì)空白角蛋白凝膠進(jìn)行了鐵離子吸附動(dòng)力學(xué)擬合，通過對(duì)比，其吸附行為更符合二級(jí)吸附動(dòng)力學(xué)。運(yùn)用Weber-Morris內(nèi)擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)模型對(duì)凝膠的鐵離子吸附行為進(jìn)行研究，結(jié)果表明影響凝膠吸附性能的因素包括溶液中外部質(zhì)量傳遞與內(nèi)擴(kuò)散，兩者共同影響凝膠對(duì)鐵離子的吸附。通過SEM，F(xiàn)T-IR，以及XRD對(duì)角蛋白進(jìn)行表征，結(jié)果表明凝膠具有較好的孔隙度，孔徑大小為20-100

7、μm，大量的孔徑有利于藥物的裝載和鐵離子的吸附。XRD和FT-IR結(jié)果表明，凝膠對(duì)鐵離子吸附成功。
　?、鄄捎霉渤练e法制備出載鹽酸米諾環(huán)素角蛋白凝膠。體外釋藥擬合結(jié)果顯示，藥物主要以擴(kuò)散方式進(jìn)行的釋放。凝膠載藥量對(duì)其鐵離子螯合性能影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載藥量為12%的載藥凝膠具有較好的鐵離子螯合能力，前120min螯合較快，鐵離子清除率達(dá)到44.16±2.35%，凝膠吸附率增長較快，為5.18±0.24μg/mg；120-360mi

8、n時(shí)間內(nèi)，鐵離子螯合速度降低，凝膠吸附率增長緩慢，360min時(shí)，鐵離子清除率為59.70±3.37%；360min以后，由于藥物全部釋放，鐵離子的螯合速度減慢，720min時(shí)刻，鐵離子清除率為62.38±4.14%，凝膠吸附率為7.20±0.50μg/mg。同樣使用SEM，F(xiàn)T-IR以及XRD對(duì)載藥凝膠進(jìn)行表征，表明藥物包埋過程為物理過程。
　?、苓M(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察載藥角蛋白凝膠對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性以及神經(jīng)保護(hù)性能。當(dāng)凝膠濃度增

9、大到200μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率明顯下降，當(dāng)濃度持續(xù)增高到800μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率降低至51.55±10.09%（P<0.01），結(jié)果表明載藥角蛋白凝膠具有輕微的細(xì)胞毒性。通過向培養(yǎng)液中加入血紅素（25μM）造成細(xì)胞鐵毒性，經(jīng)載藥凝膠孵育受損細(xì)胞24h后，細(xì)胞存活率隨著凝膠濃度升高逐漸增高，當(dāng)凝膠濃度達(dá)到400μg/mL時(shí)，與對(duì)照組（50.88±15.62%）相比，細(xì)胞存活率增至94.22±8.57%，表明角蛋白凝膠對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有