雙層魚膠原膜作為微粒皮移植覆蓋物的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　創(chuàng)面修復(fù)是燒傷領(lǐng)域永恒的命題，尤其對于大面積燒傷患者，創(chuàng)面修復(fù)尤其關(guān)鍵，直接關(guān)系到患者的存活率及生存質(zhì)量。大面積創(chuàng)面引起機(jī)體應(yīng)激嚴(yán)重，消耗過度，并且容易引細(xì)菌定植、進(jìn)而引起全身感染，導(dǎo)致全身臟器損傷。盡早的覆蓋創(chuàng)面是燒傷患者治療的關(guān)鍵，因而創(chuàng)面覆蓋物的選擇與進(jìn)展是貫穿燒傷發(fā)展始終的，其中包括臨時覆蓋物與永久的覆蓋物。永久的覆蓋主要指真皮替代物和字體皮，大面積救治治療過程中應(yīng)用的主要植皮方式有:Meek植皮術(shù)、自異體

2、混合植皮術(shù)、微粒皮移植術(shù)以及自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植等，然而，任何一種植皮方式都需要合適的臨時覆蓋物來覆蓋間隙以及保證永久覆蓋物存活。臨時覆蓋物的發(fā)展也對創(chuàng)面修復(fù)起到了重要的作用，臨時覆蓋從傳統(tǒng)的紗布、凡士林紗布、陰離子輔料等到膠原膜或膠原支架覆蓋物，應(yīng)用越來越廣泛。因此，創(chuàng)面覆蓋物的更新發(fā)展，也是創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)的發(fā)展的重要支持。
　　在大面積燒傷封閉創(chuàng)面的過程中，各種植皮方式應(yīng)用各有利弊。其中，Meek植皮術(shù)多應(yīng)用于早起切痂后覆蓋創(chuàng)面

3、，實現(xiàn)了擴(kuò)展比例可為1∶3至1∶9，并且實現(xiàn)了機(jī)械化，但是擴(kuò)展比例有限;自異體混合植皮術(shù)，植皮存活率穩(wěn)定，但存在手術(shù)重復(fù)操作多，耗時長等缺點;自體表皮細(xì)胞培養(yǎng)移植，理論可擴(kuò)展1000倍，但是存在創(chuàng)面愈合質(zhì)量差的問題;微粒皮移植術(shù)理論上可擴(kuò)展100倍，臨床應(yīng)用可擴(kuò)展10～20倍，但是存在覆蓋物選擇、方向性及均一性等臨床難題。本研究著眼于微粒皮移植，覆蓋物的選擇一直是影響微粒皮移植成活率的重要因素，活性高的異體皮是理想的微粒皮移植覆蓋物，但

4、是異體皮來源受限往往限制了大面積燒傷患者的微粒皮移植開展，因而，尋找一種可以模擬皮膚功能的覆蓋物對微粒皮移植十分關(guān)鍵。
　　在諸多覆蓋物材料的發(fā)展中，其中在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域，膠原材料的使用越來越廣泛。膠原自身為創(chuàng)面修復(fù)過程中所需要的重要成分，并且在皮膚及創(chuàng)面修復(fù)中起重要作用。并且，膠原的獲取途徑越來越多，提取方式及加工方式越來越成熟。在創(chuàng)面修復(fù)方面，膠原的應(yīng)用也越來越廣泛，已有的產(chǎn)品包括真皮替代物及外用敷料。近年來，魚來源的膠原材料越

5、來越多的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其中包括止血材料及創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域，如何利用魚膠原材料促進(jìn)創(chuàng)面愈合具有重大臨床意義。
　　本研究旨在尋找一種可替代異體皮膚功能的生物敷料，結(jié)合魚膠原的應(yīng)用發(fā)展，構(gòu)建一種模擬皮膚結(jié)構(gòu)功能的雙層魚膠原膜，并將之應(yīng)用于微粒皮移植覆蓋物，為微粒皮移植提供一種來源廣泛的覆蓋物選擇，從而使微粒皮移植在大面積燒傷患者的創(chuàng)面修復(fù)中應(yīng)用更廣，創(chuàng)面修復(fù)效率更高。
　　第一部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)的構(gòu)建
　　研究

6、目的:制備一種模擬皮膚結(jié)構(gòu)，包含表皮真皮，并且在功能上模擬皮膚的雙層膠原敷料，外層可以模擬表皮致密并且韌性高具備保護(hù)及隔絕功能;內(nèi)層疏松柔軟，具備良好的貼附功能。用于創(chuàng)面可以達(dá)到吸收滲液，并且可以保護(hù)創(chuàng)面。
　　研究方法:利用食用廢料的羅非魚魚皮與魚鱗，經(jīng)酸聯(lián)合酶消化提取技術(shù)，提取并純化魚膠原。在不添加具有毒性的交聯(lián)劑的基礎(chǔ)上，應(yīng)用不同的交聯(lián)方法可以獲得理化特性差別明顯的膠原膜。利用脫水熱處理(DHT，dehydrothermal

7、 treatment)交聯(lián)的方法得到外層魚膠原膜(FCM-O，F(xiàn)ish Collagen Membrane Outer-layer)，利用真空冷凍干燥(FC，vacuum Frozen drying)技術(shù)得到內(nèi)層魚膠原膜(FCM-I，F(xiàn)ish CollagenMembrane Inner-layer)。將制備好的FCM-O提前鋪在制備FCM-I的模具底部，再次利用真空冷凍干燥技術(shù)，制備成膜。
　　研究結(jié)果:成功制備具有雙層結(jié)構(gòu)，外

8、層致密柔韌，內(nèi)層疏松柔軟的雙層魚膠原膜，從外觀上和質(zhì)地上與人皮膚具有相似性。
　　第二部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)的特性研究
　　研究目的:通過FCM-B的結(jié)構(gòu)特性及理化特性檢測來驗證雙層魚膠原膜與皮膚結(jié)構(gòu)和功能上的相似性。
　　研究方法:
　　1.結(jié)構(gòu)觀察
　　1.1.組織學(xué)觀察利用FCM-B冰凍切片，行HE染色、Massion染色，觀察其結(jié)構(gòu)與膠原排列情況，并與正常皮膚組織切片做對比，觀察其結(jié)構(gòu)的相

9、似性;
　　1.2.電鏡掃描觀察并對FCM-B進(jìn)行掃描電鏡掃描，觀察膠原膜的結(jié)構(gòu)，觀察各層次的表征，并測量各層次的厚度。
　　2.物理特性
　　2.1.力學(xué)性能取FCM-O，F(xiàn)CM-I及FCM-B啞鈴型樣本，利用Instron5567材料測試系統(tǒng)(Instron，USA)，進(jìn)行力學(xué)測試，獲得楊氏模量、斷裂伸長率及斷裂強(qiáng)度等指標(biāo)，重復(fù)測量3遍。
　　2.2.水蒸氣透過率(WVTR，Water Vapor Trans

10、mission Rate)取直徑3.5cm的FCM-O，F(xiàn)CM-I及FCM-B樣本，使用水蒸氣透過率檢測儀（W3/030，Labthink，中國）獲得結(jié)果，測量重復(fù)3次。
　　2.3.吸收容量(C％)將已經(jīng)制備好的三種膠原膜用雙蒸水浸泡，在相同環(huán)境浸泡相同時間直至膠原膜充分吸收水分，通過測量浸泡前后膠原膜質(zhì)量變化計算C％。
　　3.生物化學(xué)特性
　　3.1.生物可降解性將制備的FCM-B、FCM-O及FCM-I用PBS

11、處理，浸泡前后的干重計算降解速率，并計算半量降解時間t1/2。
　　3.2.細(xì)胞毒性將FCM浸提液按一定濃度剃度加入等量人成纖維細(xì)胞懸液中，使用CCK-8試劑盒，通過檢測吸光度(OD)值，計算成纖維細(xì)胞的相對增值率。
　　統(tǒng)計方法:FCM的各項指標(biāo)（計量資料）結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;兩組值之間應(yīng)用t檢驗;多組組比較應(yīng)用oneway-ANOVA分析，實驗組與各組間比較應(yīng)用SNK檢驗。
　　研究結(jié)果:
　　1.結(jié)

12、構(gòu)觀察組織學(xué)切片結(jié)果顯示FCM-B冰凍切片與正常皮膚組織切片在雙層結(jié)構(gòu)和膠原排列上具有結(jié)構(gòu)相似性;電鏡掃描結(jié)果顯示FCM-B在厚度與孔隙上上與皮膚表皮真皮具有相似性。
　　2.物理學(xué)特性通過檢測測得FCM-I機(jī)械性能顯著FCM-O(p＜0.05); FCM-I的WVTR顯著高于FCM-O(p＜0.05)，F(xiàn)CM-B的WTVR接近正常皮膚水平。FCM-I吸收容量顯著高于FCM-O(p＜0.05)。
　　3.生物化學(xué)性能檢測體外

13、降解時間T1/2(FCM-O)約為15天;T1/2(FCM-I)約為21天，F(xiàn)CM-O的生物降解時間明顯長于FCM-I(p＜0.05)。細(xì)胞毒性試驗表明FCM浸提液對人成纖維細(xì)胞增值率無顯著影響。
　　第三部分:雙層魚膠原膜(FCM-B)覆蓋SD大鼠微粒皮移植實驗
　　研究目的:為了驗證雙層膠原膜在微粒皮移植過程中能起到異體皮的作用，能夠促進(jìn)微粒皮移植創(chuàng)面的愈合。
　　研究方法:SD大鼠背部做直徑2cm的圓形全層皮膚缺

14、損創(chuàng)面，根據(jù)1∶10的比例將取下的皮膚取薄皮制備成微粒，回植在創(chuàng)面上，根據(jù)覆蓋物的不同分為空白對照組、異體皮覆蓋組及FCM-B、FCM-I、FCM-O覆蓋組，觀察不同覆蓋物對微粒皮移植存活的影響，計算創(chuàng)面愈合率及收縮率;留取組織標(biāo)本，分別進(jìn)行膠原(Massion)染色、HE染色，觀察表皮細(xì)胞生長情況及創(chuàng)面的膠原分布情況。
　　統(tǒng)計方法:多組組比較應(yīng)用oneway-ANOVA分析，實驗組與各組間比較應(yīng)用SNK檢驗。
　　研究結(jié)

15、果:實驗早期發(fā)現(xiàn)FCM-I、FCM-O創(chuàng)面愈合不佳，在3周時FCM-B覆蓋組與異體皮覆蓋組的創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，創(chuàng)面收縮率異體皮覆蓋組低于FCM-B(p＜0.05)，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)上皮形成厚度FCM-B組大于異體皮覆蓋組(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　本研究構(gòu)建的雙層膠原膜，在結(jié)構(gòu)上與皮膚的表皮真皮具有高度的相似性，并且在理化特性上接近理想創(chuàng)面覆蓋物要求，通過動物實驗結(jié)果證實，F(xiàn)CM-B替代同