墨西哥黃唇魚膠原肽促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合作用的研究.pdf

1、以人工增殖放流的墨西哥黃唇魚（加利福尼亞灣石首魚）肉為原料，經(jīng)復(fù)合酶解得到墨西哥黃唇魚膠原肽(Totoaba macdonaldi-meat collagen peptides，TMCP)，圍繞其促進(jìn)皮膚傷口愈合的性能及可能的生物學(xué)機(jī)制，分別從體外細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果匯總?cè)缦?
　　(1)TMCP的酶法制備:以墨西哥黃唇魚肉為原料，采用復(fù)合酶法(Alcalase堿性蛋白酶、Flavourzyme復(fù)合風(fēng)

2、味蛋白酶)，以水解度(DH)為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為:酶解溫度55℃、水解時(shí)間4h、體系pH7.0、酶總用量1.0％，該條件下實(shí)際測(cè)得DH為63.90％。采用Waters凝膠色譜法測(cè)得該TMCP平均分子量(Mw)為837Da，由5～8個(gè)氨基酸組成;采用日立全自動(dòng)氨基酸分析儀從中檢測(cè)出22種氨基酸，其中富含羥脯氨酸(1.24％)、γ-氨基丁酸(1.03％)、?；撬?0.74％)和鳥氨

3、酸(0.37％)，具有高的營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)用保健價(jià)值。
　　(2)體外細(xì)胞水平試驗(yàn):探究TMCP對(duì)成纖維細(xì)胞株NIH/3T3增殖、遷移及膠原合成的影響。采用CCK8法測(cè)定，顯示TMCP能促進(jìn)NIH/3T3細(xì)胞的增殖，在所試濃度范圍(25～100μg/mL)內(nèi)，TMCP對(duì)細(xì)胞增殖率的促進(jìn)作用和對(duì)羥脯氨酸含量的提升效果都極顯著地高于對(duì)照組(p＜0.01)，與陽性對(duì)照藥物(bFGF)相當(dāng);當(dāng)試樣濃度為50μg/mL時(shí)，表現(xiàn)出最佳效果。選擇該TM

4、CP濃度進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，經(jīng)36h全程監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組自12h起，與對(duì)照組相比，極顯著地提高了細(xì)胞的遷移率(p＜0.01)，與bFGF效果相當(dāng)。
　　(3)整體動(dòng)物試驗(yàn):采用小鼠皮膚皮膚創(chuàng)傷模型，對(duì)40只健康雄性ICR小鼠進(jìn)行切除型傷口造模處理，造模后次日起分別用低、中、高三個(gè)劑量的TMCP(0.66、1.33、2.0g/kg·bw)和等體積的去離子水（空白對(duì)照）連續(xù)灌胃14d，每隔2d測(cè)定傷口愈合率。分別于造模后的第7d和第14

5、d分批處死動(dòng)物，取傷口邊緣的皮膚組織，經(jīng)HE染色和Masson染色進(jìn)行組織學(xué)觀察，并測(cè)定羥脯氨酸含量和進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果表明，在第7d、14d時(shí)，TMCP中、高劑量組在傷口愈合率、膠原含量、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)表達(dá)量等指標(biāo)上均極顯著優(yōu)于對(duì)照組(p＜0.01);