動脈管壁“孫絡—微血管”滋生在動脈粥樣硬化早期病變中的作用及通絡干預研究.pdf

1、目的:本研究以脈絡學說營衛(wèi)“由絡以通、交會生化”理論為指導，通過單純高脂飲食建立兔動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)早期病變模型，通過動態(tài)觀察其血脂變化、主動脈缺氧狀況、管壁微血管密度、主動脈內皮依賴性舒張功能及主動脈內膜病理等變化過程，以及主動脈組織中炎癥和氧化應激相關因子的表達，探討管壁“孫絡-微血管”滋生在AS早期病變中的作用及相關機制;采用高脂飲食疊加頸動脈包裹硅膠管，建立兔AS早期管壁“孫絡-微血管”滋生病變

2、動物模型，通過觀察管壁微血管的空間密度，進一步探討通心絡對管壁微血管滋生的干預效果和作用機制，為揭示脈絡學說營衛(wèi)“由絡以通、交會生化”理論的科學內涵提供實驗依據。
　　方法:通過文獻檢索與資料整理，在深入挖掘中醫(yī)文獻的基礎上，圍繞營衛(wèi)學說與血脈理論，以脈絡學說為指導，探討動脈管壁微血管滋生在AS早期病變中的作用，以及營衛(wèi)“由絡以通，交會生化”異常與AS早期管壁微血管病變的關系以及通絡藥物作用機制。
　　1、動脈管壁“孫絡-微

3、血管”滋生在動脈粥樣硬化早期病變中的作用
　　采用高脂飲食喂養(yǎng)新西蘭兔建立AS早期病變動物模型，動態(tài)觀察其主動脈缺氧狀況、管壁微血管密度、主動脈內皮依賴性舒張功能及主動脈內膜的病理變化等。將110只普通級新西蘭兔隨機分為正常飲食組(50只)和高脂飲食組（60只）。正常飲食組給予普通飼料，高脂飲食組給予高脂飼料（配方:膽固醇1％，蛋黃粉7.5％，豬油5％，基礎飼料86.5％），每兔每日喂食100g,分2次喂飼,自由飲水，實驗周期共6

4、周。兩組動物分別于高脂喂食后3天、1周、2周、4周和6周末各隨機取2只動物用于主動脈整體油紅O染色，8～10只動物用于其它指標的檢查。處死前禁食12h，留取血液標本和組織標本，檢測血脂四項水平、血清內皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)水平、MDA、SOD、T-AOC活性，采用離體血管環(huán)檢測腹主動脈內皮依賴性血管舒張功能;光鏡下觀察各組動物腹主動脈形態(tài)學變化;免疫組織化學染色方法檢測腹主動脈組織中CD34抗體、HIF-1α抗體表達;分

5、子生物學檢測主動脈組織中HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1 mRNA和蛋白表達。
　　2、通心絡對管壁“孫絡-微血管”滋生、炎癥及氧化應激水平的影響
　　采用高脂飲食配合頸動脈包裹硅膠管的方法來建立新西蘭兔頸動脈管壁微血管滋生病變模型，觀察通心絡對管壁微血管滋生的干預效果并探討其作用機制。手術方法:動物稱重麻醉后仰臥位固定于術臺，分層切開皮膚并分離皮下筋膜及肌肉組織，用眼科鑷配合玻

6、璃分針小心剝開總動脈鞘膜，分離出長約3cm的頸總動脈，把消毒后的硅膠管(長28mm，內徑1.7mm，外徑3.2mm)，縱向剖開后包裹于左側頸總動脈，并在硅膠管縫隙處涂少量道康寧硅膠732，然后將頸動脈放回原位，再予青霉素16萬單位局部注射預防感染。將290只普通級新西蘭兔隨機分為正常組、模型組、阿托伐他汀組和通心絡高、中、低劑量組，正常組40只，其余各組每組50只。正常組喂飼普通顆粒飼料，其余各組動物均給予高脂飼料并配合左側頸動脈硅膠管

7、包裹，各治療組在造模當天同時給予藥物干預。給藥量為:阿托伐他汀2.5mg/kg，通心絡高劑量0.6g/kg、中劑量0.3g/kg，低劑量0.15g/kg。實驗前用0.5％羧甲基纖維素鈉水溶液分別將藥物配制成混懸液，阿托伐他汀濃度為0.83mg/ml，通心絡高、中、低劑量濃度分別為0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml，灌胃體積均為3ml/kg，每日1次。所有實驗動物均自由飲水，實驗周期為6周。每組動物分別于給藥后3天、1周、2

8、周、4周和6周末各隨機8～10只動物進行相關指標檢查。血脂四項、ET-1、NO水平、MDA、SOD、T-AOC活性檢測;光鏡下觀察各組動物左側頸動脈形態(tài)學變化及管壁微血管內皮細胞超微結構;Micro-CT和免疫組化檢測左側頸動脈管壁微血管密度(MVD);彩色微球法檢測微血管內血流量變化;RT-qPCR檢測NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2及NQO1基因相對表達量;Western Blot檢測動脈組織總NF-κB、核NF-κB、T

9、NF-α、IL-6、總Nrf2、核Nrf2及NQO1蛋白表達水平。
　　3、通心絡對管壁“孫絡-微血管”滋生DLL4/Notch信號通路的影響
　　造模方法及實驗分組同第三部分。采用RT-qPCR檢測動脈組織中VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1 mRNA相對表達量;Western Blot檢測動脈組織VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1蛋白表達。
　　結果:
　　1、動脈管壁“孫

10、絡-微血管”滋生在動脈粥樣硬化早期病變中的作用
　　1.1各組動物不同時間節(jié)點血脂水平變化
　　高脂飲食組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平于高脂喂養(yǎng)2周到6周時依次明顯升高，而且均高于同期正常飲食組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)
　　1.2腹主動脈形態(tài)學變化（油紅O染色和HE染色）
　　主動脈整體油紅O染色:正常飲食組主動脈大體觀察呈乳白色，彈性較好，內膜光滑平整，未見油紅著色。高脂

11、飲食喂養(yǎng)3天、1周、2周后，其主動脈油紅O染色結果與正常飲食組比較未見明顯變化，而在高脂喂養(yǎng)4周、6周后，其主動脈彈性稍差，內膜可見少量斑片狀紅色區(qū)域，即脂質條紋形成，多位于胸主動脈下段、腹主動脈及其有分支的地方。
　　光鏡觀察（HE染色）主動脈內中膜變化:正常組及高脂喂養(yǎng)3天、1周、2周時主動脈內膜內皮細胞完整連續(xù)，胞核扁平，與內彈力版貼合緊密，中膜平滑肌走行清晰;4周時動脈內膜處見少量泡沫狀巨噬細胞形成，中膜間隙增寬;6周時內

12、膜明顯增厚，內皮下可見大量泡沫細胞積聚，部分彈力纖維波紋斷裂或消失，中膜間隙增寬明顯。
　　光鏡觀察（HE染色）主動脈外膜變化:正常組主動脈、高脂喂養(yǎng)3天、1周時主動脈外膜可見少量微血管;高脂喂養(yǎng)2周后外膜微血管數量開始增多。
　　1.3主動脈管壁微血管密度和HIF-1α抗體表達（免疫組化）比較
　　高脂飲食組主動脈管壁微血管密度（CD34抗體染色陽性）從高脂喂養(yǎng)2周至6周出現進行性增加（P均＜0.05），且均高于同期

13、正常飲食組(P＜0.05或P＜0.01)。兩組動物主動脈HIF-1α抗體染色顯示自3天至4周均未出現明顯的陽性表達，唯6周時高脂飲食組主動脈HIF-1α抗體染色稍有弱陽性表達。
　　1.4不同時間節(jié)點腹主動脈內皮依賴性血管舒張功能變化
　　從3天至6周，正常飲食組內皮依賴性血管舒張功能在各時間節(jié)點均高于90％;高脂飲食組內皮依賴性血管舒張功能于4周至6周時呈現出進行性下降，分別為53.55％和49.95％，并且均低于同期正常

14、飲食組，差異有顯著性（P均＜0.01）。
　　1.5內皮依賴性血管舒張功能與管壁微血管密度相關性分析
　　以模型組管壁微血管密度為自變量，內皮依賴性血管舒張功能為因變量對二者進行Spearman相關性分析，結果顯示相關系數為r=-0.824，P＜0.01，二者呈顯著負相關關系，提示動脈舒張功能在一定范圍內隨著管壁微血管密度的增加而降低。
　　1.6血清ET-1、NO、SOD、MDA及T-AOC水平變化
　　與正常

15、飲食組比較，高脂飲食組血清ET-1和MDA水平進行性升高，組間差異在4周和6周時均出現統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）;血清NO、SOD及T-AOC水平則表現為進行性下降，均低于同期正常飲食組，亦在4周和6周時出現顯著性差異（P均＜0.01）。
　　1.7主動脈HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1 mRNA表達比較（4周）
　　與正常飲食組比較，高脂飲食組主動脈組織中HIF-1α、NF-

16、κB及Nrf2的mRNA表達均未出現顯著性差異(P＞0.05); TNF-α和IL-6的mRNA表達顯著升高（P均＜0.01），γ-GCS和HO-1的mRNA表達則顯著降低(P均＜0.01)。
　　1.8主動脈HIF-1α、NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2、γ-GCS及HO-1蛋白水平比較（4周）
　　與正常飲食組比較，高脂飲食組主動脈組織中HIF-1α的蛋白水平未見顯著性差異(P＞0.05); NF-κB、TNF

17、-α和IL-6的蛋白水平顯著升高(P均＜0.05或P＜0.01);Nrf2、γ-GCS及HO-1蛋白水平則顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。
　　2、通心絡對管壁“孫絡-微血管”滋生、炎癥及氧化應激水平的影響
　　2.1各組動物血脂水平變化
　　模型組血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平于高脂喂養(yǎng)2周到6周依次明顯升高，且均高于同期正常飲食組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。與模型組

18、比較，阿托伐他汀組和通心絡高、中劑量組給藥后2周TC和LDL-C水平開始出現顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，阿托伐他汀組的下降幅度大于通心絡高、中劑量組，但未出現統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，此三組之間TC水平在給藥4周和6周時無明顯差異(P＞0.05);三組TG水平從4周開始明顯下降(P＜0.05或P＜0.01);三組HDL-C水平4周到6周雖高于模型組，但未出現統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;通心絡低劑量組在各個時間點與模型組相比

19、均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.2各組動物血清ET-1、NO、MDA、SOD及T-AOC水平比較
　　與正常組比較，模型組血清ET-1水平、MDA含量進行性升高，均在4周和6周時差異出現統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）;血清NO、SOD及T-AOC水平表現為進行性下降，且均低于同期正常組，也均在4周和6周時出現顯著性差異（P均＜0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組和通心絡高劑量組在給藥后4周時，通心絡中劑量組在給藥6

20、周時，血清ET-1和MDA水平開始顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，血清NO、SOD及T-AOC水平開始明顯上升(P＜0.05或P＜0.01)，且三組之間無顯著性差異（P＞0.05）;通心絡低劑量組各項指標在各個時間點與模型組比較均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)。
　　2.3各組動物頸動脈組織形態(tài)學變化
　　2.3.1光鏡下觀察(HE染色)
　　正常組及未包管側頸動脈內膜光滑，內皮細胞完整連續(xù)，胞核扁平，與內彈力

21、版貼合緊密，中膜平滑肌走行清晰，外膜可見少量微血管。
　　模型組術側（左側）頸動脈形態(tài)學變化明顯:(1)血管內膜:包管3天時內膜完整無增生;1周時內膜輕度增生;2周到6周時內膜出現彌漫性增生，并進行性加重，新生內膜中以單核細胞為主。(2)血管中膜:包管3天到1周時，內彈力板彎曲，中膜輕度增厚;2周時內彈力板彎曲加重;4周到6周時中膜間隙增寬，平滑肌細胞和彈力纖維排列紊亂。(3)血管外膜:包管3天時外膜微血管數量增多，1周時炎癥細胞

22、浸潤明顯，2周到
　　6周時外膜微血管密度進一步增加。
　　與同期模型組比較，阿托伐他汀組、通心絡高、中劑量組術側頸動脈病理損傷均有不同程度減輕:內膜增生減輕，內皮下泡沫細胞數量減少，內彈力板彎曲，部分彈力纖維排列紊亂，中膜平滑肌走行清晰，增生不明顯，外膜微血管數量不同程度減少，炎癥細胞浸潤減輕。
　　2.3.2透射電鏡觀察管壁微血管內皮細胞超微結構
　　正常組:內皮細胞完整，形態(tài)正常，結構清晰，胞漿內線粒體形態(tài)

23、正常，并可見吞飲小泡，細胞間連接緊密，細胞外基質膜連續(xù)完好。
　　模型組:內皮細胞萎縮、破損，細胞內線粒體部分嵴和膜融合甚至消失，并可見空泡樣變，細胞間隙擴張，細胞間連接斷裂、部分脫落，細胞外基質松散、不連續(xù)，部分區(qū)域溶解。
　　各治療組:均可不同程度減輕上述超微結構的改變，整個細胞結構基本正常，部分細胞內偶見空泡樣變，以通心絡高劑量組內皮細胞形態(tài)與結構病變最為輕微。
　　2.4各組動物頸動脈管壁微血管密度比較

24、　　模型組頸動脈管壁微血管密度于實驗后第3天開始持續(xù)升高，與同期正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，阿托伐他汀組和通心絡高劑量組在給藥后4周和6周時，頸動脈管壁微血管密度均明顯減少（P均＜0.05），且兩者之間無顯著性差異（P＞0.05），通心絡中、低劑量組在各時間點與之相比均未出現統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　2.5各組動物頸動脈管壁微血管血流量比較
　　模型組頸動脈管壁微血管血

25、流量于1周開始持續(xù)升高，與同期正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，通心絡高劑量組在給藥后4周到6周，通心絡中劑量在給藥后6周，頸動脈管壁微血管血流量均明顯下降（P均＜0.05），阿托伐他汀組、通心絡低劑量組在各時間點與之相比均未出現統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　2.6各組動物術側頸動脈4周時NF-κB、TNF-α、IL-6、Nrf2及NQO1mRNA表達比較
　　與正常組比較，模型

26、組TNF-α、IL-6 mRNA表達顯著上升高，NQO1mRNA表達明顯降低（P均＜0.01），NF-κB、Nrf2 mRNA表達均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與模型組比較，阿托伐他汀組、通心絡高、低劑量組TNF-α mRNA表達均明顯下降(P＜0.01)，同時，各用藥組IL-6 mRNA表達亦明顯下降，且NQO1 mRNA表達上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2.7各組動物4周時總NF-κB、核NF-κB、TNF-α、

27、IL-6、總Nrf2、核Nrf2、及NQO1蛋白表達變化
　　正常組、模型組、及各用藥組總NF-κB、總Nrf2蛋白表達未見明顯差異(P＞0.05)。
　　與正常組比較，模型組核NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，阿托伐他汀組、通心絡大劑量組的核NF-κB蛋白表達明顯下降(P＜0.01)，通心絡大劑量組TNF-α蛋白表達和各用藥組IL-6蛋白表達亦明顯下降(P＜0.05)。

28、>　　與正常組比較，模型組核Nrf2、NQO1蛋白表達顯著下降(P＜0.05);與模型組比較，阿托伐他汀組、通心絡大、中劑量組核Nrf2蛋白表達明顯上升(P＜0.05或P＜0.01)，各用藥組NQO1蛋白表達亦不同程度增加(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3、通心絡對管壁“孫絡-微血管”滋生DLL4/Notch信號途徑的影響
　　各組動物VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1 mRNA表達比較:與正常組比較

29、，模型組頸動脈組織中VEGF-A和VEGF-R2的mRNA表達均顯著上升，DLL4和Notch1的mRNA表達均明顯下降（P均＜0.01）;與模型組比較，阿托伐他汀組及通心絡各劑量組VEGF-A和VEGF-R2的mRNA表達均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，同時，阿托伐他汀組和通心絡高、中劑量組中DLL4和Notch1的mRNA表達均明顯上升(P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡高、中劑量組VEGF-A、VEGF-R2的m

30、RNA表達和DLL4、Notch1的mRNA表達均未出現統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。
　　各組動物VEGF-A、VEGF-R2、DLL4及Notch1蛋白表達比較:與正常組比較，模型組頸動脈組織中VEGF-A和VEGF-R2的蛋白表達均顯著上升，而DLL4和Notch1的蛋白表達均明顯下降（P均＜0.01）;與模型組比較，阿托伐他汀組及通心絡高、中劑量組VEGF-A和VEGF-R2的蛋白表達均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01

31、)，同時，阿托伐他汀組和通心絡各劑量組DLL4和Notch1的蛋白表達明顯上升(P＜0.01);與阿托伐他汀組比較，通心絡高、中劑量組VEGF-A、VEGF-R2的蛋白表達和DLL4、Notch1的蛋白表達均未出現統(tǒng)計學差異（P均＞0.05）。
　　結論:
　　1.本研究通過高脂飲食建立兔AS早期病變模型，外膜管壁微血管滋生早于大血管結構與功能損傷和內膜脂質條紋形成而發(fā)生，即微血管病變早于大血管病變，且大血管內皮依賴性舒張功

32、能隨著血管外膜管壁微血管密度的增加而降低，提示管壁微血管滋生促進了AS早期病變的發(fā)生發(fā)展。在管壁微血管滋生過程中，炎癥水平上升和抗氧化應激能力下降發(fā)揮著重要作用。
　　2.通過頸動脈包裹硅膠管配合高脂飲食建立兔AS早期管壁微血管滋生病變模型。通心絡通過抑制NF-κB核轉位和促進Nrf2核轉位，降低頸動脈組織的炎癥水平，提高其抗氧化能力，保護管壁微血管結構的完整性，從而抑制了管壁“孫絡-微血管”滋生，最終減輕了AS早期病變。

33、　　3.AS早期管壁微血管滋生與DLL4/Notch信號通路受到抑制有關，通心絡通過活化該信號通路，同時抑制VEGF-A、VEGF-R2的基因和蛋白表達，從正反兩方面調節(jié)了血管生成，減輕了AS早期病理改變。
　　4.本研究以脈絡學說為指導，基于孫絡與微血管解剖形態(tài)學上的同一性，指出了動脈管壁“孫絡-微血管”是營氣與衛(wèi)氣“由絡以通，交會生化”，維持動脈營養(yǎng)代謝的重要途徑和處所，“孫絡-微血管”營衛(wèi)“由絡以通，交會生化”異常所致的動脈