外膜滋養(yǎng)血管新生在動脈粥樣硬化早期病變中的作用及通絡干預研究.pdf

1、目的：本研究以中醫(yī)脈絡學說及營衛(wèi)理論為指導，采用單純高脂飲食建立兔AS早期病變高脂血癥模型，高脂飲食疊加右側頸動脈硅膠管包裹術建立復合模型，通過觀察3天、1周、2周和4周時間節(jié)點各組頸動脈病理形態(tài)、血脂、外膜滋養(yǎng)血管新生變化情況，探討外膜滋養(yǎng)血管新生在AS早期病變中的作用；根據模型制備成功時間，選擇術后4周為時間節(jié)點，圍繞交感/副交感神經和氧化應激，深入探討AS早期外膜滋養(yǎng)血管新生相關機制及通絡藥物的干預作用。
　　方法：⑴180

2、只健康新西蘭兔適應性喂養(yǎng)2周后隨機分為正常組、高脂組及復合模型組，每組60只。正常組給予普通飼料，高脂組給予高脂飲食喂養(yǎng)建立AS早期高脂血癥模型，復合模型組給予高脂飲食疊加右側頸動脈硅膠管包裹術，實驗周期為4周。于術后3天、1周、2周和4周末行左心室灌注Microfil造影劑進行Micro-CT檢查；DYE-TRAK彩色微球檢測術側頸動脈管壁微血管血流量；生化法檢測血脂水平；HE染色觀察頸動脈病理形態(tài)學變化；Western Blot檢測

3、頸動脈外膜新生微血管CD34蛋白表達。⑵90只健康新西蘭兔隨機分為正常組、高脂組、復合模型組、復合模型+桂芍通絡高劑量組、復合模型+桂芍通絡低劑量組和復合模型+阿托伐他汀組，各組15只。造模同第一部分。各治療組實施高脂飲食復合右側頸動脈硅膠管包裹，于造模當天同時給予藥物干預，用0.5％羧甲基纖維素鈉混懸液將藥物配成所需濃度，給藥劑量為：桂芍通絡高劑量0.6g/kg/d、低劑量為0.3g/kg/d（相當于臨床等效量），阿托伐他汀2.5mg

4、/kg/d，灌胃容積為3ml/kg，其他組別同第一部分，給藥4周后取材。生化法檢測血脂水平、黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶（SOD）；TBA法檢測丙二醛（MDA）；化學比色法檢測總抗氧化能力（T-AOC）；HE染色檢測術側頸動脈形態(tài)學變化；原位雜交檢測外膜 p22phox、gp91phox雜交信號；Micro-CT檢測術側頸動脈外膜微血管密度；彩色微球檢測微血管灌注血流量變化；免疫組化檢測頸動脈外膜 NGF、TH表達情況；Wester

5、n Blot檢測頸動脈組織 NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、ERK及 p-ERK蛋白表達水平。⑶90只健康新西蘭兔隨機分為正常組、高脂組、復合模型組、復合模型+PD98059（ERK抑制劑）組、復合模型+桂芍通絡高劑量組、復合模型+PD98059+桂芍通絡高劑量組，各組15只。提前將100ul PD98059溶解液置于25ml25%Pluronic@F-127凝膠液中，制成PD98059載藥凝膠（終濃度為200μmol

6、/L）。將0.5ml緩釋凝膠導管注入硅膠管，包裹于右側頸動脈，抑制外膜局部ERK信號通路。于造模當天同時給予桂芍通絡灌胃，實驗周期為4周。HE染色觀察動物術側頸動脈形態(tài)學變化；彩色微球檢測微血管血流量變化；免疫組化檢測頸動脈外膜NGF表達情況；Western Blot檢測頸動脈外膜中NGF、TrkA、VEGF、ERK及p-ERK蛋白表達。
　　結果：①與正常組比較，高脂組血清TC、TG、LDL-C水平于高脂喂養(yǎng)2周到4周逐漸升高，

7、復合模型組TC、TG、LDL-C水平于1周到4周逐漸升高，且差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與高脂組相比，復合模型組血清TC、TG、LDL-C水平于1周時明顯升高，統(tǒng)計學差異具有顯著性（P<0.01），2周和4周時仍有升高趨勢。正常組頸動脈內膜光滑呈波浪狀，內皮細胞完整連續(xù)，中膜以平滑肌細胞為主；高脂組和復合模型組3天、1周內皮細胞完整，胞核扁平，中膜平滑肌走形清晰，2周內膜輕微增厚，4周內膜增生，中膜間隙增寬；而復合模型組4周內膜

8、彌漫性增生，可見少量泡沫狀巨噬細胞，血管中膜間隙增寬，平滑肌和彈力纖維排列紊亂，損傷程度較高脂組更重。②正常血管滋養(yǎng)管沿頸動脈規(guī)則的縱向排列，高脂組和復合模型組頸動脈術側血管壁面積及微血管密度自術后1周開始持續(xù)升高，與同期正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與高脂組相比，復合模型組術側血管壁面積及微血管密度從實驗1周后出現增加趨勢，2周和4周微血管密度明顯增加，外膜滋養(yǎng)血管呈致密的微血管叢分布，有顯著統(tǒng)計學差異（

9、P<0.05，P<0.01）。③與同期正常組相比，高脂組術側管壁微血管血流量自術后2周開始升高（P<0.05）；復合模型組在1周時已出現升高趨勢，2周后呈進行性升高（P<0.01）；相較于高脂組，復合模型組管壁微血管血流量在1周和2周時即出現升高趨勢，4周時管壁微血管血流量明顯升高（P<0.05）。④正常頸動脈外膜新生微血管CD34蛋白表達量較少；高脂組CD34蛋白表達量自1周至4周呈進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05， P<0

10、.01）；而復合模型組CD34蛋白表達量從3天至4周呈進行性升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。⑤與正常組比較，高脂組和復合模型組血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與復合模型組比較，復合模型+桂芍通絡高劑量組、復合模型+桂芍通絡低劑量組和復合模型+阿托伐他汀組給藥后血清 TC、TG和 LDL-C水平明顯降低，有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）；各用藥組之間兩兩比較無顯著統(tǒng)計學差異

11、（P>0.05）。⑥與正常組比較，高脂組和復合模型組血清MDA水平顯著升高，血清SOD及T-AOC水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與復合模型組比較，復合模型+桂芍通絡高劑量組、復合模型+桂芍通絡低劑量組和復合模型+阿托伐他汀組給藥后血清MDA水平下降（P<0.01），血清SOD和T-AOC水平明顯升高（P<0.01），各用藥組之間兩兩比較無顯著統(tǒng)計學差異（P>0.05）。⑦正常組頸動脈內膜光滑，內皮細胞平整連續(xù)，與內彈力板貼

12、合緊密，中膜以平滑肌細胞為主，走行清晰，外膜可見少量微血管；高脂組內膜增生，中膜間隙增寬，外膜微血管數量增多；復合模型組內膜彌漫性增生，可見少量泡沫狀巨噬細胞，血管中膜間隙增寬，平滑肌和彈力纖維排列紊亂，外膜微血管數量豐富；各用藥組頸動脈病理損傷不同程度減輕：內膜增生減輕，部分彈力纖維排列紊亂，中膜平滑肌走行較清晰，外膜微血管數量不同程度減少。⑧正常組主動脈呈乳白色，內膜光滑，未見油紅著色；高脂組主動脈彈性較差，可見少量斑片狀紅色區(qū)域；

13、復合模型組主動脈彈性差，胸主動脈下段、腹主動脈及分支部分可見斑片狀紅色，即脂質條紋；各藥物干預組內膜斑片狀紅色分布減少，內膜較光滑。⑨正常組中gp91phox和p22phox基因雜交信號表達量極少，高脂組和復合模型組gp91phox和p22phox mRNA雜交顆粒廣泛分布，尤以內膜和外膜部位顯著，各用藥組gp91phox和p22phox mRNA雜交信號在內膜、外膜分布均有不同程度減弱。⑩與正常組比較，高脂組NGF、TH、AchE、V

14、EGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達上調（P<0.01）；與高脂組比較，復合模型組NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達顯著上調，有顯著統(tǒng)計學差異（P<0.01）；與復合模型組比較，復合模型+桂芍通絡高劑量組、復合模型+低劑量組和復合模型+阿托伐他汀組 NGF、TH、AchE、VEGF、VEGFR-2、p-ERK蛋白表達明顯下調（P<0.01），各用藥組間兩兩比較無顯著統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

15、r>　　結論：①本研究以營衛(wèi)理論與脈絡學說為指導，探討動脈管壁 VV新生在AS早期病變中的作用。基于營行脈中與血管內皮相關，衛(wèi)行脈外與血管外膜相關，“孫絡”與“微血管”在解剖形態(tài)學上的同一性，以高脂飲食損傷內皮建立高脂血癥兔模型，高脂飲食疊加右側頸動脈硅膠管包裹術損傷外膜建立復合模型，探討動脈管壁VV新生在AS早期病變中的作用及營衛(wèi)通絡方藥干預作用，不僅有助于揭示營衛(wèi)“由絡以通，交會生化”異常的病理生理學基礎，對于闡明AS“由外向內”的

16、發(fā)病機制，尋找有效的干預藥物具有重要意義。②以高脂飲食建立高脂血癥兔模型，高脂飲食疊加右側頸動脈硅膠管包裹術建立復合模型，與正常組比較，高脂組1周時微血管新生CD34蛋白表達量上調，微血管密度增加，2周時微血管灌注血流量升高；而復合模型組3天時CD34蛋白表達量較正常組上調，3天及1周時CD34蛋白表達量明顯高于高脂組，1周時微血管密度較高脂組出現升高趨勢，2周和4周時升高有統(tǒng)計學差異，微血管灌注血流量1周時出現較高脂組升高趨勢，4周較

17、高脂組明顯升高；頸動脈形態(tài)學示高脂組及復合模型組2周時內膜輕微增厚，4周時明顯增生，而復合模型組4周時內膜增生程度較高脂組嚴重，以上結果表明高脂可引起外膜VV新生，且先于內膜增生發(fā)生；復合模型可引起外膜VV新生程度加重，最終影響并加重AS病變程度。③與正常組比較，高脂組和復合模型組血管內膜和外膜均可見明顯的gp91phox和p22phox mRNA雜交顆粒分布，血清MDA水平顯著升高，血清SOD及T-AOC水平下降；高脂組NGF,Trk

18、A，TH, AchE，VEGF，VEGFR-2， p-ERK1/2蛋白表達量上調，NE表達量增加，微血管密度及灌注血流量增加，而復合模型組除NE及微血管密度外，其余上述指標均較高脂組升高，表明高脂組和復合模型組在引起外膜 VV新生的同時伴有氧化應激損傷及交感神經過度激活，復合模型組交感神經激活程度較高脂組嚴重；NGF/TrkA/ERK1/2通路參與交感神經過度激活促進外膜 VV新生的病理過程。④以營衛(wèi)理論與脈絡學說指導研制的營衛(wèi)通絡方—