鴨肝炎病毒的純化及其單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV，duckhepatitisvirus)引起的主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、高度致死性的傳染病。本試驗主要對鴨肝炎病毒進行增殖、鑒定和純化，利用純化的病毒作為抗原免疫小鼠并建立了間接ELISA篩選方法，并經(jīng)過一系列的融合篩選成功制備了抗鴨病毒性肝炎的單克隆抗體，從而為實驗室建立DVH的快速診斷方法及今后對DHV的研究奠定基礎。 本試驗用鴨胚進行DHV增殖，運用Reed-Muench法測

2、定DELD50為10-7.12，0.2mL；鴨胚中和試驗鑒定此DHV為I型鴨肝炎病毒；通過氯仿去脂、PEG反透析、DEAE52纖維素層析和超高速離心的純化方法對病毒進行了純化。純化后的病毒經(jīng)負染在電鏡下觀察可看到圓形、大小均一、直徑約為15nm左右的病毒粒子。用純化的病毒液接種雛鴨，進行回歸試驗，可以引起雛鴨“角弓反張”的典型癥狀與肝臟出血等病理變化。 用純化的病毒作為抗原來免疫BALR/c小鼠后建立間接ELISA篩選方法。細胞

3、融合前經(jīng)反復試驗，確定了間接ELISA篩選陽性雜交瘤細胞株的最佳反應條件，即：抗原包被濃度為50μg/mL，以1:5000稀釋的陰、陽性血清分別作為陰、陽性對照，反應條件均以37℃50min為佳，酶標二抗的工作濃度為1:6000。取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合，用間接ELISA方法篩選出3株陽性雜交瘤細胞株，將獲得的陽性細胞株用有限稀釋法進行3次亞克隆，篩選出2株能穩(wěn)定分泌McAb的細胞株，分別命名為1D10和586。

4、對這2株雜交瘤細胞株的穩(wěn)定性、染色體、亞類、抗原表位特異性、親和力、腹水效價、特異性進行了鑒定，結果如下：在經(jīng)過3個月的連續(xù)傳代和3個月后的復蘇檢測，其分泌抗體的能力差異不顯著，表明其穩(wěn)定性好；染色體數(shù)目平均在84—92條之間：經(jīng)亞類鑒定，2株雜交瘤細胞分泌的抗體類型均為IgG1亞類，輕鏈類型均為k鏈；經(jīng)抗原表位特異性分析，2株單克隆抗體的識別表位相同或相近；其相對親和力的測定結果是1D10>5B6；抗體效價為1D10>5B6，其中1D