豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp7蛋白單克隆抗體的制備及抗原表位的鑒定.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的,該病1987年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn),1991年在荷蘭分離到病毒,我國(guó)于1996年分離到第一株病毒(CH-1a株)。目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國(guó)家,給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Nsp7蛋白是PRRSV的一個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白,免疫原性高,已經(jīng)證實(shí),在感染PRRS

2、V的豬體內(nèi)含有針對(duì)Nsp7蛋白的特異性抗體,且抗體在體內(nèi)的持續(xù)時(shí)間很久,另外,Nsp7在不同毒株之間具有很高的保守性,是建立PRRSV鑒別診斷方法的理想靶蛋白。但目前對(duì)Nsp7蛋白的抗原表位知之甚少,本研究主要利用單克隆抗體和合成多肽來(lái)確定Nsp7蛋白的抗原表位,從而為研制新型診斷試劑奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.PRRSV WUH1株Nsp7基因的克隆表達(dá)
　　 提取PRRSV WUH1株的總RNA,利用特異

3、性引物通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得Nsp7基因,并將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a中,獲得原核表質(zhì)粒pET-28a-Nsp7。在IPTG誘導(dǎo)下6His-Nsp7融合蛋白獲得高效表達(dá),表達(dá)的融合蛋白分子量為37KDa,主要以可溶性形式存在。Western blotting檢測(cè)證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫學(xué)活性。
　　 2.PRRSV WUH1株Nsp7蛋白單克隆抗體的制備
　　 將原核表達(dá)的PRRSV Nsp7蛋白經(jīng)Ni-N

4、TA柱純化后作為免疫原,免疫6周齡BALB/C雌性小鼠,經(jīng)細(xì)胞融合,間接ELISA方法篩選,共獲得19株抗Nsp7蛋白的單克隆抗體(D1F9、D3G10、D1E9、B2B3、B3D6、B1F7、B2E11、B1F5、D1C11、C4G7、C2A8、C2D11、B2G3、C3C7、B1F8、C4B2、B4H10、B4E2、D1C10)。采用秋水仙素裂解法對(duì)篩選到的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),染色體數(shù)在90～105條之間。亞類(lèi)分析顯示除B1

5、F7為IgM亞類(lèi)外其余均IgG1。
　　 將19株雜交瘤細(xì)胞分別注射小鼠后,大量制備腹水。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-Nsp7轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,收集樣品。經(jīng)Western blotting和IFA驗(yàn)證表明除D1F9以外均能與真核表達(dá)的Nsp7蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 3.PRRSV Nsp7蛋白抗原表位的確定
　　 結(jié)合相關(guān)生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)的Nsp7蛋白潛在的抗原表位的結(jié)果,將Nsp7蛋白截短成四個(gè)

6、小的片段(pN71(1～116aa)、pN72(56～163aa)、pN73(112～213aa)和pN74(142～252aa)),分別構(gòu)建這四個(gè)片段的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-pN71、pET-28a-pN72、pET-28a-pN73和pET-28a-pN74。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,四個(gè)融合蛋白均獲得高效表達(dá)。通過(guò)Western Blotting和間接ELISA驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn):19

7、株抗Nsp7蛋白單抗中13株抗體可直接或間接的與pN72發(fā)生反應(yīng)。
　　 根據(jù)上述的結(jié)果,設(shè)計(jì)了一套包含整個(gè)pN72片段和其它潛在的抗原表位的16個(gè)短肽片段(SP1～SP16),每個(gè)多肽的長(zhǎng)度約為15個(gè)aa,每相鄰的短肽之間有5個(gè)aa的重復(fù)。通過(guò)間接ELISA的方法與19株抗Nsp7單抗進(jìn)行反應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn):D1E9,D1C10,D3G10與SP9和SP10有特異性反應(yīng),B1F5與SP10有特異性反應(yīng),其它的抗體與多肽之間均無(wú)反應(yīng)