桐花樹耐鹽基因的克隆、功能表達及其適應性進化的研究.pdf

1、影響農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的最主要因素是環(huán)境脅迫，其中又以鹽脅迫和干旱脅迫最為嚴重。解決這一問題最直接的途徑是利用基因工程手段，培育耐鹽作物品種。由于鹽生植物可能具有進化上與非鹽生植物截然不同的信號轉(zhuǎn)導機構(gòu)和調(diào)節(jié)控制機制，因此，分離識別鹽生植物耐鹽相關(guān)基因的研究不僅可以豐富我們對于植物耐鹽機制的認識，而且可以為開發(fā)利用鹽生植物耐鹽基因資源，培育耐鹽作物品種奠定基礎，目前分離識別鹽生植物耐鹽相關(guān)基因已逐漸成為國際上植物耐鹽領(lǐng)域的一個研究熱點。

2、 提取高質(zhì)量的RNA是進行植物耐鹽基因表達研究的前提。紅樹所含的大量次生物質(zhì)給RNA提取造成了較大困難。經(jīng)過摸索，本文發(fā)展了一項低成本，高效率且無需液氮的RNA提取方法。用該法制得的總RNA能夠滿足后續(xù)多種分子生物學實驗的要求。在此基礎上，本文首次構(gòu)建了紅樹植物桐花樹(Aegicerascorniculatum)3％海水脅迫下的正向抑制性扣除文庫，一共獲得602個質(zhì)粒，整理測序結(jié)果共獲得575條表達序列標簽(ESTs)。并利用Mi

3、croarray技術(shù)對該文庫中566個克隆子進行了500mMNaCl脅迫2小時，5小時兩個時間段基因表達譜的分析。共鑒定出68個至少在兩個生物學重復中發(fā)生了差異表達的克隆子。其中63個為上調(diào)表達的克隆子，5個為下調(diào)表達的克隆子。這一結(jié)果與我們構(gòu)建的是正向文庫的實驗設計相吻合。對該文庫克隆子進行序列和表達模式分析表明：桐花樹在受到鹽脅迫時，既采取了一些與甜土植物相同的應答機制，又采取了一些特有的抗鹽途徑。為深入了解桐花樹中鹽誘導基因的功能

4、，本文利用RACE技術(shù)克隆了5個桐花樹鹽誘導基因的全長cDNA序列，并選取了AcP5CS和AcCPI兩個基因進行轉(zhuǎn)基因擬南芥研究。轉(zhuǎn)基因擬南芥研究結(jié)果表明：轉(zhuǎn)AcP5CS和轉(zhuǎn)AcCPI基因植株均獲得了比對照組更高的抗鹽能力。且在5種鹽度下轉(zhuǎn)AcCPI基因植株的生長狀況均優(yōu)于轉(zhuǎn)AcP5CS基因植株和對照組。 為了解桐花樹抗鹽基因AcP5CS是否存在適應性進化，本文擴增了桐花樹以及紫金?？破渌麑俟?0個物種的P5CS基因的部分CDS

5、序列，兩兩計算了Ks-Ka的值。結(jié)果表明：所檢測的20個物種的P5CS在其所研究的序列內(nèi)均未發(fā)生適應性進化。這項結(jié)果與自然界只在極少數(shù)基因發(fā)現(xiàn)了適應性進化的事實相一致。本論文的研究工作改進了現(xiàn)有RNA提取技術(shù)，對紅樹植物鹽誘導SSH文庫的構(gòu)建和芯片點制、雜交，克隆全長cDNA,功能鑒定等實驗功能基因組學的研究取得了初步結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一批新的抗逆基因，為進一步研究其基因結(jié)構(gòu)和時空表達譜及其生物學功能奠定了基礎，即為實驗室建立了紅樹植物功能基因