小麥V-H+-ATPase基因的克隆及耐鹽性研究.pdf

1、鹽害導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，是造成全球糧食危機(jī)的主要因素之一，培育耐鹽轉(zhuǎn)基因作物是一個(gè)快速有效的解決方法，但缺乏有效的目的基因是限制植物耐鹽基因工程進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。本論文的主要目的就在于尋找新的小麥耐鹽相關(guān)基因，研究它們的功能，以期為植物耐鹽分子機(jī)制的深入了解及今后培育抗鹽高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小麥提供有價(jià)值的參考。
　　 本實(shí)驗(yàn)以小麥耐鹽突變體(RH8706-49)和敏鹽突變體(H8706-34)為材料(二者是“一粒傳”后代，它們的農(nóng)藝性狀十

2、分相似而耐鹽性卻有明顯差異，經(jīng)滄州市農(nóng)林科學(xué)院多年人工模擬鹽池鑒定，RH8706-49的耐鹽指數(shù)≥1.3，H8706-34的耐鹽指數(shù)≤0.50)，克隆了小麥V-H+-ATPase(Vacuolar proton-ATPase)B，F(xiàn)，G，H，c五個(gè)亞基，分析了1％鹽和50μM ABA脅迫下小麥V型H+-ATPase基因(A，B，C，D，F(xiàn)，G，H，a，c，d)的表達(dá)模式，并進(jìn)一步將小麥V型H+-ATPaseB基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因

3、擬南芥耐鹽性進(jìn)行研究。主要實(shí)驗(yàn)如下：
　　 1．小麥V-H+-ATPase B，F(xiàn)，G，H，c亞基基因克隆及序列分析利用已經(jīng)克隆的植物V-H+-ATPase亞基序列信息(水稻，大麥等)，通過EST拼接方法獲得小麥V型H+-ATPase邏輯序列，設(shè)計(jì)引物克隆到小麥V型H+-ATPase B，F(xiàn)，G，H，c亞基的全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 小麥V-H+-ATPase B subunit cDNA含有一個(gè)1467bp的開放閱讀框

4、，編碼長(zhǎng)達(dá)488個(gè)氨基酸殘基，分子量約54.0kDa的多肽，是一個(gè)比較保守的亞基。進(jìn)化分析表明小麥V-H+-ATPase B亞基核苷酸序列與大麥和水稻液泡膜來源的H+-ATPase B亞基具有高度同源性。F subunit cDNA含有一個(gè)393bp的開放閱讀框，編碼長(zhǎng)130個(gè)氨基酸殘基，分子量約14.4kDa的多肽。G subunit cDNA含有一個(gè)333bp的開放閱讀框，編碼長(zhǎng)110個(gè)氨基酸殘基，分子量約12.4kDa的多肽。Hs

5、ubunit cDNA含有一個(gè)1359bp的開放閱讀框，編碼長(zhǎng)452個(gè)氨基酸殘基，分子量約51.4 kDa的多肽。c subunit cDNA含有一個(gè)498bp的開放閱讀框，編碼長(zhǎng)165個(gè)氨基酸殘基，分子量約16.6kDa的多肽。進(jìn)化分析它們與大麥和水稻來源的液泡膜H+-ATPase亞基具有較高的氨基酸序列相似性，同源性高達(dá)95%以上。
　　 這些基因序列的獲得，有利于對(duì)小麥V-H+-ATPase生物意義的重要性進(jìn)行更全面和深入

6、的研究。
　　 2．小麥V-H+-ATPase亞基A，B，C，D，F(xiàn)，G，H，a，c，d的表達(dá)模式為了研究小麥V-H+-ATPase與非生物脅迫的關(guān)系，我們利用Real-Time PCR對(duì)小麥1%NaCL和50μMABA(0，1，6，12，72h)脅迫下根和葉的表達(dá)模式進(jìn)行分析。
　　 2.1 1%NaCL耐鹽突變體49經(jīng)鹽脅迫后，根葉中V-H+-ATPase各亞基總體表達(dá)水平明顯高于脅迫前水平，總體表達(dá)趨勢(shì)為隨鹽脅迫時(shí)

7、間的延長(zhǎng)而表達(dá)量增高。在敏鹽突變體34中，鹽脅迫后V-H+-ATPase各亞基在根中的表達(dá)量顯著低于脅迫前水平，而葉中各亞基總體表達(dá)水平在鹽脅迫后稍高于脅迫前水平。
　　 2.2 50μM ABA耐鹽突變體49根中，V-H+-ATPase各亞基的總體表達(dá)水平在ABA脅迫后6h和12h時(shí)表達(dá)量略高于脅迫前水平，在其余時(shí)段呈下調(diào)表達(dá)；在葉中各亞基脅迫后的總體表達(dá)水平高于脅迫前水平，在24h達(dá)到表達(dá)高峰，這與鹽脅迫時(shí)的表達(dá)趨勢(shì)一致。在

8、敏鹽突變體34中，ABA脅迫后V-H+-ATPase各亞基在根中的總體表達(dá)水平低于脅迫前水平；在葉中各亞基脅迫后的總體表達(dá)水平高于脅迫前水平，在th和24h有兩個(gè)表達(dá)高峰，其總體變化趨勢(shì)與鹽脅迫時(shí)的一致。
　　 小麥耐鹽突變體49 V-H+-ATPase各亞基(A，B，C，D，F(xiàn)，G，H,a，c，d)在受到非生物脅迫時(shí)，表達(dá)量協(xié)調(diào)增高，說明提高V-H+-ATPase基因的表達(dá)量，可增強(qiáng)植物的耐鹽性。
　　 3．小麥V-H

9、+-ATPase B耐鹽性的研究為了進(jìn)一步確定V-H+-ATPase B基因的功能，我們構(gòu)建了植物表達(dá)雙元載體，通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥植株，對(duì)獲得的純合體植株進(jìn)行了耐鹽性鑒定，對(duì)鹽脅迫條件下，分別對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的種子萌發(fā)率，幼苗，根生長(zhǎng)情況以及完整植株的耐鹽性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在含NaCl MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株生長(zhǎng)狀態(tài)和成活率明顯好于對(duì)照植株，并且V-H+-ATPaseB基因的過量表達(dá)可以明顯增強(qiáng)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株幼苗根的正常生