Ppbi-1基因?qū)O誘發(fā)的細(xì)胞死亡和黃酮類次生代謝產(chǎn)物合成積累的影響研究.pdf

1、高等植物細(xì)胞程序性死亡(細(xì)胞凋亡)和次生代謝產(chǎn)物合成積累是受細(xì)胞內(nèi)部相關(guān)基因調(diào)控的復(fù)雜生理生化活動,研究表明外界刺激因子可以通過產(chǎn)生NO等信號分子介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成。Bax inhibitor-1(bi-1)是一個新型的凋亡調(diào)控基因,它可以抑制由Bax以及生物、非生物因素引起的模式植物細(xì)胞死亡。因此,為探討NO是否依賴相同的信號途徑誘發(fā)細(xì)胞死亡和次生代謝物質(zhì)合成,本文通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建雌二醇誘導(dǎo)型Ppbi-1(紫竹中克

2、隆鑒定而得)基因工程飛廉細(xì)胞株,獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后,研究了Pp-bi-1基因表達(dá)對NO誘發(fā)的飛廉細(xì)胞死亡和次生代謝產(chǎn)物合成的影響,初步探討了NO介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。主要實驗結(jié)果如下： (1)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的PER8-Ppbi-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化飛廉愈傷組織細(xì)胞 通過菌落PCR、回轉(zhuǎn)酶切篩選出陽性的PER8-Pp-bi-1/EHA105農(nóng)桿菌菌株,以1:250的菌液濃度,暗處感染飛廉愈傷組織細(xì)胞30min,共培養(yǎng)后以30mg/

3、L的Hyg作為選擇濃度篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞,在12血細(xì)胞中篩選獲得28個抗性細(xì)胞系。這說明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法適用于飛廉愈傷細(xì)胞。 (2)轉(zhuǎn)誘導(dǎo)型Ppbi-1基因飛廉細(xì)胞鑒定 對獲得的28個抗性細(xì)胞系,通過80mg/L的Hyg再次篩選,得到15個抗性細(xì)胞系,進(jìn)一步的PCR分子鑒定,得到11個轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,PCR檢測和Western blotting檢測的結(jié)果表明,外源Ppbi-1基因已成功轉(zhuǎn)入飛廉的愈傷組織細(xì)胞基因組中,并

4、在20μmol·L-1雌二醇(Est)誘導(dǎo)下能夠穩(wěn)定表達(dá)。 (3)飛廉轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸浮系的建立及培養(yǎng)條件優(yōu)化 在固體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)Ppbi-1基因飛廉細(xì)胞中,挑選健康的愈傷細(xì)胞接種到MS液體培養(yǎng)基,為使轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能夠更好生長,對液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到最適的培養(yǎng)條件為：以pH 5.8的MS+1×10-5MNAA+2×10-6MBA+258/L蔗糖為培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度25℃,搖床轉(zhuǎn)速100rpm,接種量為3g/50ml培

5、養(yǎng)基；以此培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞,能得到分散、均一且生長迅速的懸浮細(xì)胞系；測定細(xì)胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)該懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長周期為14天；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)期間,定期的PCR檢測,保證了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的穩(wěn)定性,避免了培養(yǎng)中出現(xiàn)的一些假陽性細(xì)胞,為進(jìn)一步實驗提供了可靠的實驗材料。 (4)Ppbi-1基因表達(dá)對NO誘發(fā)的飛廉細(xì)胞死亡和次生代謝產(chǎn)物合成的影響NO是一個新型信號分子,可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡和促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成。本實驗中,利用NO供體SNP處理處

6、于對數(shù)生長期轉(zhuǎn)基因飛廉懸浮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在0.5mM濃度處理下細(xì)胞出現(xiàn)褐化死亡,NO專一性淬滅劑cPTIO和20μmol·L-1Est誘導(dǎo)外源基因bi-1表達(dá)均可明顯抑制由0.5mM SNP引起的細(xì)胞死亡,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Ppbi-1基因能抑制1mMSNP引起的細(xì)胞死亡。對0.5mM SNP和0.5mM SNP+20μM Est處理的飛廉轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)三天后用特異性核染料sytox染色,0.5mMSNP單獨處理的細(xì)胞大部分核被染色,而且細(xì)胞

7、核出現(xiàn)了核凝聚、以及染色質(zhì)邊集等凋亡細(xì)胞的特征；提取細(xì)胞DNA電泳分析,觀察到了DNA LADDER,這說明,該細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)生凋亡,而Est誘導(dǎo)Ppbi-1基因表達(dá)的細(xì)胞均未出現(xiàn)這些凋亡特征。以0.5mMSNP、0.5mMSNP+20μMEst、0.5mM SNP+20μMEst+1mM cPTIO處理處于對數(shù)生長末期(第9天)的細(xì)胞,第12天收獲細(xì)胞,測三組細(xì)胞的生物量和總黃酮含量,SNP單獨處理,飛廉黃酮類次生代謝產(chǎn)物合成加強(qiáng),E