懸浮培養(yǎng)銀杏細胞產(chǎn)生黃酮類物質的技術研究.pdf

1、銀杏葉中的黃酮類物質具有廣泛的藥理作用，具有廣闊的市場前景。因此實現(xiàn)銀杏細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮是保證今后市場需求的非常有希望的手段之一。本實驗以銀杏未伸展的幼葉為外植體，建立起愈傷組織培養(yǎng)體系和細胞懸浮培養(yǎng)體系，并進行了10L發(fā)酵罐培養(yǎng)，取得了較滿意的結果。 研究表明，銀杏葉片和葉柄在很多培養(yǎng)基上都能誘導出愈傷組織，葉片和葉柄在MS附加激素NAA1.0mg·L-1，6-BA1.0mg·L-1培養(yǎng)基上誘導率分別達到100﹪和80﹪

2、，可以作為最佳誘導培養(yǎng)基。同時還得出結論，葉片的誘導效果要比葉柄的好。銀杏愈傷組織培養(yǎng)過程中很容易褐變，致使繼代培養(yǎng)無法進行，加入3.0mg·L-1Vc可以很好的控制褐變。不同激素組合對細胞生長和黃酮類物質合成有較大影響，3.00mg·L-1NAA+1.00mg·L-16-BA最有利于細胞生長和黃酮類物質的合成，30天細胞增長量達4.88g·瓶-1，黃酮合成量達11.20mg·g-1。實驗得知，銀杏愈傷組織在固體培養(yǎng)基中細胞生長和黃酮累

3、積均呈S型曲線，20天細胞鮮重達最大值，25天黃酮含量達最高。 在此基礎上，建立了葉來源的懸浮細胞體系。結果表明，1.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA的激素組合下，細胞鮮質量增加最多，達3.64g·瓶-1，1.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA處理下總黃酮含量最高，達11.01mg·g-1。培養(yǎng)基pH為6.0時，細胞增長量和總黃酮含量都達到最大值，細胞生長量3.96g·瓶-1，總黃酮含量10.08m

4、g·g-1。對于銀杏細胞來說，細胞生長和黃酮類物質累積的最適蔗糖濃度均為35g·L-1。添加微量乙烯利(≤60mg·L-1)使細胞干重和黃酮類物質積累都有提高，但提高乙烯利濃度，則無論細胞干重和總黃酮含量都迅速下降。茉莉酸甲酯抑制細胞生長，且濃度越高，抑制作用越強，添加一定濃度的茉莉酸甲酯可以使銀杏黃酮產(chǎn)量提高，實驗結果表明，培養(yǎng)第9天添加20μmol·L-1濃度的茉莉酸甲酯可以有效提高總黃酮產(chǎn)量而不影響細胞生長，其中總黃酮含量可達到1

5、0.93mg·L-1。 本文還探討了兩相培養(yǎng)對銀杏細胞產(chǎn)生黃酮類物質的影響，以正十六烷為第二相，以二甲基亞砜作為產(chǎn)物釋放劑，正十六烷的加入對細胞生長有抑制作用，對黃酮類物質的合成有促進作用，細胞干重隨著正十六烷含量的增加而減少，總黃酮產(chǎn)量隨著正十六烷含量的增加而增加，最高可達125.36mg·L-1。 利用10L氣升式生物反應器培養(yǎng)培養(yǎng)銀杏細胞，裝液量為5L，pH為5.8時較有利于細胞的生長和黃酮的積累，其細胞干重可達1