產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88菌毛蛋白與LTb的原核表達(dá)及其鼻腔免疫的研究.pdf

1、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹瀉的主要病原之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)大約有35％的仔豬腹瀉是因感染ETEC引起的；美國(guó)等國(guó)家新生仔豬腹瀉中，由ETEC引起的占45％以上。ETEC所導(dǎo)致的腹瀉發(fā)病率和死亡率都很高，給畜牧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，世界各國(guó)都在致力于開(kāi)發(fā)有效的疫苗來(lái)防治ETEC所引起的腹瀉。
　　ETEC致病因子主要包括腸毒素(ente

2、rotoxins)和黏附素(定居因子，fimbriae)。當(dāng)病原菌感染宿主后，ETEC通過(guò)菌毛黏附到小腸黏膜上皮細(xì)胞刷狀緣受體上，使ETEC在腸道內(nèi)定居繁殖，釋放腸毒素，與小腸細(xì)胞膜上的特異受體結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)水、電解質(zhì)失衡，造成細(xì)胞吸收障礙，導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。豬源ETEC的黏附素類型主要有K88、K99、987P、F17，F(xiàn)18、F41、F42；其中，引起仔豬腹瀉的菌毛主要以K88為主。腸毒素包括不耐熱腸毒素(Heat-labileen

3、terotoxin，LT)和耐熱腸毒素(Heat-stable enterotoxin，ST)兩種。
　　LTb是大腸桿菌：不耐熱腸毒素的亞單位，因其具有無(wú)毒性且有很好黏膜免疫佐劑效果而被廣泛研究應(yīng)用。鼻黏膜組織分布著鼻相關(guān)淋巴組織和豐富的血管，通過(guò)鼻腔免疫能夠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，且免疫途徑方便。在本試驗(yàn)研究中，將K88和LTb通過(guò)鼻腔免疫BALB/c小鼠，期望能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的黏膜和系統(tǒng)免疫反應(yīng)。為開(kāi)發(fā)一種針對(duì)ETEC的安

4、全有效、免疫接種方便的新型基因工程疫苗提供新的研究思路。
　　目的：將產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88菌毛蛋白與大腸桿菌不耐熱腸毒素LTb分別重組到原核表達(dá)載體中，得到純化后的重組蛋白后經(jīng)鼻腔接種免疫小鼠，觀察免疫效果。
　　方法：用PCR技術(shù)擴(kuò)增出不含信號(hào)肽的K88和LTb基因，重組到表達(dá)載體pQE30上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15中進(jìn)行表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物K88、LTb進(jìn)行純化、復(fù)性，分別用K88、K88與LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠，E

5、LISA分析各組特異性抗體水平。
　　結(jié)果：重組蛋白K88、LTb在大腸桿菌M15中獲得高效表達(dá)，經(jīng)親和層析后蛋白純度大于95％。滴鼻免疫BALB/c小鼠試驗(yàn)表明，K88與LTb聯(lián)合滴鼻免疫組血清特異性IgG及鼻腔、小腸黏膜沖洗液中特異性IgA水平均明顯增高，與K88單獨(dú)免疫組和對(duì)照組相比較差異顯著(P<0.01)。
　　結(jié)論：K88與LTb滴鼻免疫BALB/c小鼠后，不僅可以增強(qiáng)特異性血清抗體反應(yīng)，而且誘導(dǎo)了黏膜部位產(chǎn)生免