腸毒素大腸桿菌K88生物探針制備及其快速檢測分析技術(shù)研究.pdf

1、腸毒素大腸桿菌K88(ETECK88)是一種常見的腸道微生物，也是引起仔豬腹瀉和死亡的主要致病微生物。養(yǎng)殖業(yè)中準(zhǔn)確、低成本、簡便、快速地找出引起仔豬腹瀉的原因及微生物的種類甚至是血清型一直是一個(gè)難以攻克的難題，一些很好的生物產(chǎn)品如疫苗、卵黃抗體等也因此在仔豬疾病預(yù)防和治療中的不能大規(guī)模低成本應(yīng)用。建立和完善針對于ETECK88的低成本、簡便、快速分析檢測體系并實(shí)現(xiàn)在養(yǎng)殖業(yè)中的商業(yè)化應(yīng)用是降低這一類致病微生物引起的仔豬死亡的重要手段。

2、r>　　本文以ETECK88為目標(biāo)模式菌，利用生物學(xué)方法篩選和制備以K88菌毛蛋白為靶標(biāo)的單克隆抗體和適配體、以ETECK88菌體為靶標(biāo)的細(xì)胞適配體和適配體文庫，鑒定了它們與靶標(biāo)的結(jié)合性能，初步構(gòu)建了基于這幾種生物探針的檢測體系分別用于K88菌毛蛋白和ETECK88菌體的快速檢測分析。同時(shí)，成功建立了一個(gè)新的FluMag-Cell-SELEX(FluMagCellsystematicevolutionofligandsbyexponen

3、tialenrichment)細(xì)胞適配體篩選方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　本文優(yōu)化了ETECK88的發(fā)酵工藝，在優(yōu)化的玉米漿培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上制備純度和濃度滿足單克隆抗體和適配體篩選要求的K88菌毛蛋白，SDS-PAGE顯示了單一條帶，Bradford法測定濃度為0.642mg/ml。
　　利用雜交瘤技術(shù)制備并生物素化K88菌毛蛋白的單克隆抗體(K88mAb)，測定抗體效價(jià)為1∶12800，親和力常數(shù)Kaff測定為（1.6

4、16±0.033）×108M-1，流式細(xì)胞儀分析和熒光顯微鏡分析抗體與目標(biāo)菌結(jié)合性能良好，熒光分光光度計(jì)分析該抗體和ETECK88菌體有很好的結(jié)合特異性。初步建立了基于K88mAb的ABS-ELISA方法檢測K88菌毛蛋白體系，確定其檢測下限為12.53ng/ml。
　　采用多孔板法SELEX技術(shù)篩選到K88菌毛蛋白的DNA適配體，其中親和力最高的適配體Apt37Kd值達(dá)到了25±4nmol。熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)分析該適配體

5、與目標(biāo)菌結(jié)合性能良好而且有很好的結(jié)合特異性。初步建立了基于K88菌毛蛋白適配體Apt37的Aptamer-ABS-ELISA體系檢測K88菌毛蛋白，確定其檢測下限為25.1ng/ml。
　　分別采用SDS-PAGE和平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證了K88IMB(Immunomagneticbead)捕獲ETECK88的可靠性，實(shí)驗(yàn)證明K88IMB對ETECK88在102、103CFU/ml的低濃度下捕獲率分別可達(dá)74.5％和63.8％，說明K88

6、IMB可有效應(yīng)用在接下來的實(shí)驗(yàn)體系中。
　　經(jīng)典離心分離法Cell-SELEX技術(shù)與本文建立的FluMag-Cell-SELEX技術(shù)篩選ETECK88細(xì)胞適配體得到了相同的高重復(fù)度序列，說明FluMag-Cell-SELEX技術(shù)是成功的。親和力最高的細(xì)胞適配體測定Kd值為15±4nM。激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析表明適配體AptB12、FluMag-Cell-SELEX技術(shù)中最后一輪的富集適配體文庫這兩種生物探針和ETECK8