K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌sepA基因缺失株的構(gòu)建及其相關(guān)功能探析.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引發(fā)幼畜，尤其是斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌，被ETEC感染后的仔豬常因劇烈水樣腹瀉迅速脫水死亡，具有很高的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。而菌毛（黏附素）K88是ETEC引發(fā)腹瀉最重要的毒力因子之一。K88+ETEC侵入宿主腸道后，通過黏附素K88與宿主細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，從而介導(dǎo)細(xì)菌定居、繁殖、腸毒素分泌及適當(dāng)途徑的腸毒素傳遞，導(dǎo)致腹瀉。
　　實(shí)驗(yàn)根據(jù)GeneBank上已公布的一株E

2、.coli上的sepA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物以擴(kuò)增檢測K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株C83902(Wild-type，O8∶H87∶H19)中的sepA基因，根據(jù)實(shí)驗(yàn)菌株的sepA序列設(shè)計(jì)缺失引物，該缺失引物5'端與sepA兩翼序列同源，3'端與質(zhì)粒pKD3上cat基因兩翼序列同源。以質(zhì)粒pKD3為模板，應(yīng)用缺失引物擴(kuò)增出中間為cat抗性基因片段、兩端與sepA基因上下游同源的DNA片段。將其融合片段導(dǎo)入含有質(zhì)粒pKD46的C8

3、3902菌株內(nèi)，在三種重組酶的作用下，實(shí)現(xiàn)氯霉素抗性基因片段與sepA發(fā)生同源重組，在氯霉素抗性平板上挑取單菌落并進(jìn)行PCR鑒定，篩選出一次同源重組菌C83902△sepA∷cat。將質(zhì)粒pCP20導(dǎo)入一次同源重組菌內(nèi)，通過利用其編碼的Flp重組酶，進(jìn)行氯霉素抗性基因的消除，經(jīng)PCR鑒定與測序驗(yàn)證，成功構(gòu)建出C83902缺失株:C83902△sepA。
　　IPEC-J2細(xì)胞的體外黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sepA基因缺失株比野生株的黏附

4、能力下降55.3％;通過Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)檢測分析sepA基因缺失株主要毒力因子轉(zhuǎn)錄量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞭毛(fliC)、菌毛(faeG)、熱不穩(wěn)定腸毒素（eltB）、溶血素（hlyA）、Ⅰ型菌毛(fimA)基因的表達(dá)量與野生株無明顯差異;通過兔回腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)，觀察到缺失株較野生株腸段積液量更多，且缺失株導(dǎo)致回腸的病理變化更為嚴(yán)重。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SepA在介導(dǎo)C83902對(duì)宿主細(xì)胞黏附的過程中起到了一定作用，而S