K88ac+和K88ad+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌hlyA基因缺失株的構(gòu)建及其相關(guān)功能初步分體.pdf

1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)系一類致人和幼畜（初生羔羊、犢牛、羔羊及斷奶仔豬）腹瀉最常見(jiàn)的病原性大腸桿菌，其毒力因子主要包括黏附素菌毛、腸毒素、產(chǎn)志賀氏菌毒素、溶血素等。α-溶血素在ETEC的致病機(jī)理中很少受到關(guān)注，是一種RTX(repeats in toxin)毒素蛋白，對(duì)于大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）都具有溶細(xì)胞活性和細(xì)胞毒性，能夠整合

2、進(jìn)宿主細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使其內(nèi)容物滲漏或者裂解，是大腸桿菌腸外感染的一個(gè)重要的毒力因子?；贙88ac+/ K88ad+ETEC都具有溶血素基因，且兩者病原致病機(jī)理不盡相同。我們成功構(gòu)建hlyA毒素基因缺失株，為進(jìn)一步深入研究hlyA毒素與機(jī)體相互作用的分子機(jī)制，溶血素的致病機(jī)理及對(duì)豬大腸桿菌病的防控策略奠定一定基礎(chǔ)。
　　1、利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建hlyA基因缺失株
　　根據(jù)GenBank中已報(bào)道的ETEC

3、hlyA基因的序列，首先合成一對(duì)引物（引物5'端與hlyA基因同源，而3'端與pKD3質(zhì)粒上氯霉素抗性基因cat同源），經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到具有氯霉素抗性基因和hly基因同源臂的產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，在pKD46表達(dá)的重組酶作用下，PCR產(chǎn)物兩端的hlyA基因同源序列與大腸桿菌染色體上的的同源序列發(fā)生同源重組交換，利用抗性篩選得到陽(yáng)性一次重組菌。利用編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，去除氯霉素抗性基因，最后在染色體上

4、只留下一個(gè)FRT位點(diǎn)，得到二次重組菌，通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定缺失株的正確構(gòu)建。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株K88ac、K88ad的hlyA基因缺失株。同時(shí)我們將表達(dá)hlyA基因的pBR322質(zhì)粒導(dǎo)入缺失株，構(gòu)建了互補(bǔ)株。
　　2、溶血素在大腸桿菌致病過(guò)程中作用初探
　　在K88ac△hlyA、K88ad△hlyA成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上，比較分析了野生株和缺失株相關(guān)生物學(xué)特性的變化。體外生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和酵解實(shí)驗(yàn)表明，同樣的培養(yǎng)條件下，

5、缺失株K88ac△hlyA、K88ad△hlyA株生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)周期各個(gè)階段的特性與野生株相比基本沒(méi)有差異，其分解發(fā)酵糖類和氨基酸的能力也未發(fā)生改變。同時(shí)將6周齡ICR小鼠分為1個(gè)對(duì)照組和6個(gè)攻毒組，經(jīng)灌胃途徑分別對(duì)各攻毒組小鼠接種109cfu劑量的大腸桿菌懸液，定期觀察接種后小鼠的狀態(tài)（飲食、飲水、精神狀態(tài)和死亡情況），對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢記錄病理變化，結(jié)果顯示:經(jīng)野生株和回補(bǔ)株攻毒的小鼠有出血死亡的現(xiàn)象，而缺失株沒(méi)有，說(shuō)明hlyA會(huì)影