表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌STa-K99融合蛋白重組腺病毒載體的免疫學(xué)評(píng)價(jià).pdf

1、背景:產(chǎn)腸毒索性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是全球性的引起新生犢牛、羔羊和新生仔豬/斷奶仔豬嚴(yán)重水樣腹瀉的主要病原，給畜牧業(yè)造成巨大損失。在發(fā)展中國家，ETEC也是引起兒童和旅游者腹瀉的重要病原，成為人類公共衛(wèi)生安全的重要威脅。黏附素(Adhesion)和腸毒素(Enterotoxins)作為ETEC兩類主要毒力因子通常作為產(chǎn)腸毒素性火腸桿菌疫苗研究的優(yōu)勢(shì)抗原。腺病毒因其具有安全性好

2、、感染能力強(qiáng)、蛋白表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，已成為新型疫苗的理想載體[9]。目前利用腺病毒載體疫苗對(duì)腸道傳染病的免疫效果研究還未見詳細(xì)報(bào)道，尤其在預(yù)防由ETEC引起的新生動(dòng)物腹瀉的重組腺病毒載體疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià)方面尚未見報(bào)道。
　　目的:對(duì)表達(dá)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌STa-K99融合蛋白重組腺病毒載體Ad.STa-K99（實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并命名）進(jìn)行擴(kuò)增、純化，并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)研究。
　　方法:將重組腺病毒Ad.STa-K99侵染293細(xì)

3、胞進(jìn)行擴(kuò)增，隨后經(jīng)CsCl密度梯度離心進(jìn)行純化，分別通過肌肉注射、腹腔注射及灌胃免疫小鼠。同時(shí)，克隆ETEC腸毒素STa及粘附素K99融合基因STa-K99，利用原核表達(dá)載體表達(dá)融合抗原蛋白STa-K99。采用ELISA法分別檢測(cè)血清中特異性IgG、腸灌洗液中sIgA抗體、脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞分型比值;并通過動(dòng)物攻毒保護(hù)試驗(yàn)對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)攻毒后小鼠腸組織進(jìn)行病理學(xué)切片觀察。
　　結(jié)果:<

4、br>　　(1)成功擴(kuò)增、純化了重組腺病毒Ad.STa-K99，病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明重組腺病毒感染效率較高，生物活性較好。
　　(2)通過原核表達(dá)載體成功表達(dá)了融合抗原蛋白STa-K99，SDS-PAGE、WesternBlot及ELISA鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。
　　(3)動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示免疫后小鼠特異性IgG、sIgA抗體及脾臟淋巴細(xì)胞增殖活性水平顯著升高，CD4+/CD8+值顯著增大。
　　(4)動(dòng)物攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)果表明，通過腹腔注射、肌肉注射及灌胃免疫小鼠免疫保護(hù)率分別達(dá)到67％、70％及80％。
　　(5)病理學(xué)切片觀察結(jié)果表明，Ad.STa-K99免疫小鼠腸組織與粘膜均完好，微絨毛形態(tài)完整，而對(duì)照組小鼠微絨毛脫落，腸粘膜嚴(yán)重?fù)p傷。
　　結(jié)論:
　　(1)Ad.STa-K99可以通過肌肉注射、腹腔注射及灌胃方式免疫小鼠，刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的體液免疫、細(xì)胞免疫和腸道局部粘膜免疫反應(yīng)，有效保護(hù)小鼠機(jī)體免受產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌強(qiáng)