Bt Cry2Aa毒素基因工程抗體的制備及活性研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)以生物制劑或轉(zhuǎn)基因植物的形式被廣泛運用于農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲的生物防治，其在帶來巨大經(jīng)濟和社會效益的同時，也存在著生態(tài)安全隱患，因此轉(zhuǎn)Bt基因產(chǎn)品的檢測監(jiān)控技術是其產(chǎn)品安全管理、市場監(jiān)管和風險評估的技術基礎和必要保障。
　　目前檢測技術正隨著基因工程抗體的不斷發(fā)展而改革創(chuàng)新。新型抗體-十二肽和單鏈抗體(single-chain antibody fragment，scF

2、vs)已逐漸應用于免疫學檢測領域。十二肽是將隨機十二肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上，所展示的十二肽表達在pⅢ的N末端，目前主要應用于模擬抗原表位;單鏈抗體(ScFv)是重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)由氨基酸linker拼接而成，分子量約為30 kD。這些新型抗體可以保持與抗原結合的特異性并且無需免疫手段，通過原核表達大量制備。噬菌體展示技術正是篩選、制備和表達單鏈抗體的一種最有效方式，而且也是獲得抗獨特型抗體的一種新

3、的制備方式。利用噬菌體展示技術將抗體的基因型和表現(xiàn)型相結合的獨特優(yōu)勢，為進一步開展親和力成熟及蛋白結合機制等研究提供了基礎。以此為基礎，本文開展了以下三個方面的內(nèi)容:
　　1.建立基于十二肽檢測Cry2Aa毒蛋白的間接競爭ELISA檢測方法
　　利用噬菌體展示隨機十二肽庫對Cry2Aa毒素蛋白進行四輪篩選，并從第4輪產(chǎn)物中隨機挑選了20個克隆，通過單克隆ELISA法鑒定出這些克隆均能與Cry2Aa毒素特異性結合。經(jīng)過PCR擴

4、增、DNA電泳鑒定及測序，推導出8條不同的序列。挑取陽性值最高的克隆GT（氨基酸序列為GTPWHHHRHLIV），由此建立了基于十二肽的Cry2Aa毒蛋白的間接競爭ELISA檢測方法。該方法的抑制中濃度(IC50)為1.139μg/mL，最低檢測限IC10為0.0211μg/mL，線性檢測范圍為0.0478～22.691μg/mL（y=23.091gx十48.692，R2=0.9963）。噬菌體展示肽庫篩選方法為快速、準確地檢測Cry2

5、Aa毒蛋白提供了新的途徑。
　　2.建立基于單鏈抗體檢測Cry2Aa毒蛋白的雙抗夾心ELISA檢測方法
　　通過優(yōu)化固相化篩選策略，利用人源化噬菌體抗體庫(TomlinsonⅠ)篩選抗Cry2Aa毒蛋白的單鏈抗體(Single-chain antibodies，scFv)。經(jīng)4輪“擴增-吸附-洗脫”后，從最后一輪洗脫產(chǎn)物中隨機挑取200個單菌落進行單克隆ELISA鑒定，對陽性克隆進行PCR擴增、DNA電泳鑒定及測序，成功篩選

6、獲得12個陽性噬菌體scFvs，經(jīng)鑒定均有完整外源基因片段插入。將相對結合活性最好的陽性克隆scFv-A3替換到宿主菌HB2151中進行可溶性誘導表達并純化。并利用純化后的scFv-A3作為“捕獲抗體”，Anti-Cry2Aa兔多克降抗體作為“檢測抗體”，建立針對Cry2Aa的雙抗夾心ELISA檢測方法。結果表明，該方法的最低檢測限為1.08 ng/mL線性檢測范圍在7.1 ng/mL-3.8μg/mL，線性回歸方程為y=167.96x

7、+0.4513(R2=0.9909)。
　　3.Cry2Aa毒蛋白的抗獨特型單鏈抗體的篩選
　　以Cry2Aa為免疫原免疫新西蘭大白兔得到Cry2Aa的多克隆抗體。再以親和純化Cry2Aa多抗和陰性抗體作為包被原，通過扣除篩選（subtractive panning）策略在人源化噬菌體抗體庫TomlinsonⅠ中，淘選Cry2Aa毒蛋白的抗獨特型單鏈抗體。分別采取兩種試驗方案:一種是只進行一輪篩選，洗滌次數(shù)為40次;另一種是

8、進行四輪篩選，逐級降低包被原，增加洗脫次數(shù)，具體方法同抗Cry2Aa單鏈抗體的篩選方法。兩種方法均挑取200個克隆。結果顯示:只經(jīng)過一輪篩選，可獲得并鑒定出38個陽性克隆;經(jīng)過四輪篩選之后獲得125個陽性克隆。再通過與受體（小菜蛾的BBMV）結合后，其中B10的OD450為0.806最高，F(xiàn)2為0.584次之，陽性對照1.472，陰性對照0.138，無關克隆反應值0.105。說明B10和F2均與小菜蛾的BBMV有一定的結合活性，確定這2