香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的QTL定位及候選基因的驗(yàn)證研究.pdf

1、香菇(Lentinula edodes)又名，香蕈、花菇、冬菇，在中國(guó)已有上千年的栽培歷史。中國(guó)香菇栽培經(jīng)歷了三次重大的技術(shù)改革，即純培養(yǎng)栽培技術(shù)、代料栽培技術(shù)和代料栽培花菇技術(shù)，不斷擴(kuò)大了中國(guó)香菇栽培規(guī)模，使中國(guó)成為全球最大的香菇生產(chǎn)和出口大國(guó)。隨著香菇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，香菇遺傳育種研究工作的深入開展勢(shì)在必行。菌絲體是香菇重要的營(yíng)養(yǎng)器官，它能分解基質(zhì)并吸取營(yíng)養(yǎng)供香菇生長(zhǎng)發(fā)育的需要。香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度為數(shù)量性狀，受控于多基因遺傳系統(tǒng)，

2、易受環(huán)境的影響。目前，研究數(shù)量性狀的常用方法主要是對(duì)其進(jìn)行數(shù)量性狀基因座(Quantitative trait locus，QTL)定位分析，初步探索控制該數(shù)量性狀的基因，并在此基礎(chǔ)上開展分子標(biāo)記輔助育種等研究工作。
　　本研究基于香菇全基因組序列和香菇高密度SNP遺傳連鎖圖譜，對(duì)香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度進(jìn)行了QTL定位，通過(guò)生物信息學(xué)的方法初步篩選了控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的候選基因；然后開發(fā)了候選基因 SNP-CAPS標(biāo)記，結(jié)

3、合生物統(tǒng)計(jì)學(xué)鑒定驗(yàn)證了控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的基因；最后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的基因進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析，并最終確定了控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的主要基因。
　　1.香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的QTL定位
　　本研究以香菇菌株135的46個(gè)孢子單核體為定位群體，基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的香菇高密度SNP標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，利用復(fù)合區(qū)間作圖法，檢測(cè)到了3個(gè)控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的QTL，其中在L

4、G2上檢測(cè)到了一個(gè)顯著的QTL，其貢獻(xiàn)率接近30％。之后對(duì)LG2上的QTL進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該QTL與10個(gè)SNP標(biāo)記相連鎖，這些候選SNP標(biāo)記分布在5個(gè)Scaffold中。根據(jù)候選SNP標(biāo)記位點(diǎn)附近的序列信息，通過(guò)生物信息學(xué)分析，初步篩選到了控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的4個(gè)候選基因—CP、Tdc、CH、SBDS。
　　2.控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度候選基因的鑒定
　　本研究利用香菇135菌株的另外42個(gè)單核體和香菇其他系列的

5、21個(gè)單核體為鑒定驗(yàn)證群體，根據(jù)香菇全基因組序列信息和候選SNP標(biāo)記信息，通過(guò)目的片段的特異性擴(kuò)增和酶切分析，開發(fā)了6個(gè)候選基因SNP-CAPS標(biāo)記—TDSS、TDAV、CPSF、CPBS、CPFS和SBTS，得到了這些標(biāo)記在不同單核菌絲體中的基因型，并結(jié)合對(duì)應(yīng)單核菌絲體生長(zhǎng)速度的表型值進(jìn)行T檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6個(gè)候選基因SNP-CAPS標(biāo)記對(duì)香菇135系列單核菌絲體生長(zhǎng)速度具有顯著性差異，同時(shí)在香菇其他系列的單核菌絲體檢驗(yàn)顯示只有SBT

6、S這個(gè)同義標(biāo)記對(duì)生長(zhǎng)速度的影響不大，表明了控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的基因很可能就是Tdc和CP。
　　3.控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度基因的表達(dá)差異分析
　　本研究以長(zhǎng)速快的香菇單核菌絲體(65、197、224)和長(zhǎng)速慢的香菇單核菌絲體(42、89、143)為供試菌株，通過(guò)PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)和PD液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)兩種不同的條件培養(yǎng)收集菌絲，并提取香菇的總RNA，最后對(duì)控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的基因(Tdc，CH和CP)

7、進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)基因的表達(dá)量差異。結(jié)果顯示 CP基因在長(zhǎng)速快的菌株和長(zhǎng)速慢的菌株的基因表達(dá)量存在明顯差異，長(zhǎng)速快的菌株的CP基因表達(dá)量大于長(zhǎng)速慢的菌株；Tdc和CH基因的表達(dá)量則沒有明顯的差異。該結(jié)果在基因表達(dá)層面上說(shuō)明了CP基因是控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的主要基因，而Tdc和CH基因可能是控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的次要基因。
　　控制香菇單核菌絲體生長(zhǎng)速度的CP基因的初步鑒定并在基因表達(dá)層面上得到了驗(yàn)證，這為香菇