弗朗西斯菌的分離方法和基因分類研究.pdf

1、目的:
　　弗朗西斯菌屬為一類革蘭染色陰性、營養(yǎng)要求苛刻、無動力、嚴(yán)格需氧性球桿菌，可存在于多種自然環(huán)境中。該菌可胞內(nèi)寄生，對脊椎動物和無脊椎動物均可致病，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大自然界中高達(dá)百種以上的動物可感染此菌。土拉熱菌病是一種人畜共患性疾病，致死率高，其病原體為屬模式菌種土拉熱弗朗西斯菌，其傳播途徑多樣、易擴(kuò)散、毒性強(qiáng)，被美國疾病控制預(yù)防中心列為A類生物恐怖制劑之一?，F(xiàn)屬內(nèi)有6個有效命名種及6個亞種，除了土拉熱弗朗西斯菌以外，研究發(fā)現(xiàn)西

2、班牙弗朗西斯菌和蜃樓弗朗西斯菌也與人類疾病有關(guān)，但是該菌分離培養(yǎng)困難，導(dǎo)致國內(nèi)相關(guān)調(diào)查研究極少。本研究的目的：嘗試建立一種可靠、高效的從環(huán)境水樣中分離弗朗西斯菌的方法，以初步了解我國環(huán)境水系中弗朗西斯菌的主要分布菌型，對分離所得菌株運(yùn)用系統(tǒng)分類學(xué)技術(shù)分析其系統(tǒng)發(fā)育地位，進(jìn)而命名發(fā)現(xiàn)的新種。
　　方法:
　　1.弗朗西斯菌的藥物敏感性以及自制選擇性培養(yǎng)基的效果研究
　　復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室保存的蜃樓弗朗西斯菌、廣州弗朗西斯菌和嗜肺

3、軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，選用頭孢吡肟抗生素紙片對三種菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)（K-B法），依據(jù)CLSI M100-A24藥敏試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比分析。
　　復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室保存的其他標(biāo)準(zhǔn)菌株，調(diào)配菌懸液，記錄麥?zhǔn)蠞幔瑫r涂布于哥倫比亞血平板、BCYEα-GVPCC培養(yǎng)基和CHAB-PACCV培養(yǎng)基孵育培養(yǎng)，對比分析三種培養(yǎng)基上菌落生長情況，驗(yàn)證自制培養(yǎng)基的選擇性。
　　2.蜃樓弗朗西斯菌、廣州弗朗西斯菌兩株標(biāo)準(zhǔn)菌株酸抵抗性研究
　　借

4、鑒軍團(tuán)菌分離流程里的酸處理操作對兩標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行酸耐受強(qiáng)度試驗(yàn)，測定在恒定 pH=2.2的KCL-HCL緩沖液下不同培養(yǎng)基上不同時間點(diǎn)的菌落數(shù)目，繪制生存曲線，找出生存率明顯改變的時間點(diǎn)，確定水樣的酸處理時間。
　　3.培養(yǎng)基的分離效果驗(yàn)證研究
　　運(yùn)用兩標(biāo)準(zhǔn)菌株自制模擬水樣，加抽濾濃縮、酸處理因素后BCYEα-GVPCC培養(yǎng)基和CHAB-PACCV培養(yǎng)基，觀察是否能成功分離到目的菌株。
　　采集環(huán)境水樣，經(jīng)抽濾濃縮、酸

5、處理后涂布接種 BCYEα-GVPCC培養(yǎng)基CHAB-PACCV培養(yǎng)基，觀察是否能成功分離到目的菌株，保存分離菌株。
　　4.對19株分離株進(jìn)行16S rDNA、sdhA、mdh、rpoB基因測序分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株鑒定和分群，發(fā)現(xiàn)疑似新種，結(jié)合水質(zhì)和地理信息探討我國弗朗西斯菌多樣性。
　　5.運(yùn)用 DNA-DNA雜交技術(shù)對疑似新種進(jìn)行DNA-DNA相關(guān)性分析，以確證發(fā)現(xiàn)的新種。
　　結(jié)果:
　　1.頭孢

6、吡肟敏感性：蜃樓弗朗西斯菌和廣州弗朗西斯菌耐藥，嗜肺軍團(tuán)菌敏感。的對頭孢吡肟的抑菌圈分別是6mm、6mm、38mm，查閱CLSI M100-A24中收錄的所有有關(guān)頭孢吡肟的解釋標(biāo)準(zhǔn)后發(fā)現(xiàn)，前二者對頭孢吡肟為耐藥，嗜肺軍團(tuán)菌為敏感。兩種培養(yǎng)基上基本無雜菌生長或有極少量存在。
　　2. BCYEα-GVPCC和CHAB-PACCV兩種培養(yǎng)基上蜃樓弗蘭西斯菌和廣州弗朗西斯菌在 pH=2.2的酸性條件下0-20min內(nèi)生存率變化輕微，20

7、min以后其生存率顯著降低。
　　3. BCYEα-GVPCC和CHAB-PACCV兩種培養(yǎng)基均能自模擬水樣和環(huán)境水樣中成功分離到目的菌，弗朗西斯菌于前者為灰白濕潤圓形較小菌落，雜菌生長較小且少；于后者為灰綠色圓形凸起稍大菌落，非目的菌生長較多。自環(huán)境水樣中共分離得到目的菌株19株，保存于-80℃冰箱。
　　4.16S rRNA、sdhA、mdh、rpoB系統(tǒng)發(fā)育分析表明發(fā)現(xiàn)19株分離株主要以蜃樓弗朗西斯菌為主（57.90％

8、，11/19），疑似新種次之（36.84%，7/19）,疑似弗朗西斯菌科候選屬（5.26%，1/19）；主要分布于海水中（47.37%,9/19），中央空調(diào)水次之（26.32%，5/19），咸水為（21.05%，4/19），淡水分布極少（5.26%，1/19）。
　　5.10HL1970，10HP457，10HP82-10，10HL1938與08HL01032菌株的雜交率分別為25.59%，29.26%，25.61%，31.54%

9、.
　　結(jié)論:
　　1.弗朗西斯菌對頭孢吡肟耐藥，對酸有一定的抵抗性，頭孢吡肟和酸處理可用以祛除雜菌干擾，提高弗朗西斯菌的檢出率。
　　2.弗朗西斯菌在 BCYEα-GVPCC與 CHAB-PACCV均可生長，酸處理、抽濾水樣的前處理可有效用于環(huán)境水樣中弗朗西斯菌的分離培養(yǎng)。
　　3.本次研究分離的弗朗西斯菌主要以蜃樓弗朗西斯菌為主，其次為大量的潛在新種，多樣性程度較高，有潛在爆發(fā)流行的趨勢。
　　4.10