基于上轉發(fā)光免疫層析技術快速定量檢測類鼻疽伯克霍爾德菌與土拉弗朗西斯菌的方法研究.pdf

1、目的:
　　建立可對烈性病原體類鼻疽伯克霍爾德氏菌與土拉弗朗西斯氏菌直接進行現(xiàn)場檢測的上轉發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow，UPT-LF)快速定量檢測方法。
　　方法:
　　1.上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙制備:以類鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌相應的單克隆抗體作為特異性生物檢測探針，以上轉發(fā)光顆粒(up-convertingpho

2、sphor，UCP)為分析標記物，分別建立雙抗體夾心模式免疫層析試紙:類鼻疽伯克霍爾德氏菌上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙(Bur-UPT-LF)和土拉弗朗西斯氏菌上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙(Fra-UPT-LF)。
　　2.試紙檢測敏感性及特異性評價:以類鼻疽伯克霍爾德氏菌系列濃度菌懸液作為標準樣品，評價Bur-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、銅綠假單胞菌等30株種屬近緣或傳播途徑近似的菌株進行特異

3、性評價。以土拉弗朗西斯氏菌系列濃度菌懸液作為標準樣品，評價Fra-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽孢、傷寒沙門氏菌等18株傳播途徑或感染癥狀類似的菌株進行特異性評價。
　　3.試紙現(xiàn)場檢測適用性模擬評價:(1)樣品耐受性評價，采用不同濃度的純化學試劑（4類7種）和模擬樣品（8類15種）分別進行試紙對單因素樣本和實際樣品的耐受性評價。(2)操作誤差兼容性評價，設置一定程度的操作誤差，包括樣品體積偏差、樣品處

4、理液體積偏差、上樣體積偏差，模擬實驗室外、現(xiàn)場非精確操作條件下對試紙檢測性能的影響。
　　結果:
　　1.上轉發(fā)光免疫層析檢測試紙制備:將上轉發(fā)光顆粒與抗類鼻疽伯克霍爾德氏菌單克隆抗體(2E5、3D6、8G1)進行生物偶聯(lián);抗類鼻疽伯克霍爾德氏菌單克隆抗體186(3 mg/ml)和羊抗鼠IgG(3 mg/ml)分別作為檢測帶(T)和質控帶(C)固定在硝酸纖維素膜上，成功建立了Bur-UPT-LF試紙，并確定了最優(yōu)樣品處理液（

5、樣品墊處理液含1％NaCl)。將上轉發(fā)光顆粒與抗土拉弗朗西斯氏菌單克隆抗體12H1進行生物偶聯(lián);抗土拉弗朗西斯氏菌單克隆抗體(4H10+1C5)(2 mg/ml)和羊抗鼠IgG(2 mg/ml)分別作為檢測帶(T)和質控帶(C)固定在硝酸纖維素膜上，成功建立了Fra-UPT-LF試紙，并確定了最優(yōu)樣品處理液(樣品墊處理液含1％ BSA)。
　　2.試紙檢測敏感性及特異性評價:Bur-UPT-LF檢測限為104 cfu/ml;在10

6、4cfu/ml～107 cfu/ml的范圍內具有優(yōu)良的線性定量檢測能力（r=0.996）;特異性佳，與鼻疽伯克霍爾德氏菌、常見細菌類生物戰(zhàn)劑以及環(huán)境菌群等均無交叉反應。Fra-UPT-LF檢測限為104 cfu/ml;在104 cfu/ml～108 cfu/ml的范圍內具有優(yōu)良的線性定量檢測能力（r=0.995）;特異性佳，與常見細菌類生物戰(zhàn)劑以及環(huán)境菌群等均無交叉反應。
　　3.試紙現(xiàn)場檢測適用性模擬評價:(1)兩種檢測試紙均具

7、有較強的樣品單因素沖擊耐受性。Bur-UPT-LF試紙可耐受pH1-12(即HCl≤0.1 mol/L、NaOH≤0.01 mol/L)，離子強度≤2 mol/L(NaCl+KCl≤2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml與甘油≤20％,生物大分子基質干擾BSA≥400 mg/ml與干酪素≥80 mg/ml等。Fra-UPT-LF試紙可耐受pH2-13(HCl≤0.01 mol/L、NaOH≥0.1 mol/L)，離子

8、強度≥2 mol/L(NaCl+KCl≥2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml與甘油≥20％，生物大分子基質干擾BSA≥400 mg/ml與干酪素≥80 mg/ml等。(2)兩種檢測試紙均可在20min內對面粉、奶粉、膩子粉、土壤、果珍以及臟器等復雜樣品中的類鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌進行準確定量檢測;(3)樣品體積偏差(-50％～+200％)、樣品處理液體積偏差(-22％～+44％)或上樣體積偏差(-30