底板反應(yīng)蛋白(SPON1)對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤（Osteosarcoma）也稱為成骨肉瘤，是發(fā)生于兒童和未成年人的常見惡性腫瘤，約占骨原發(fā)性腫瘤的20％。骨肉瘤組織學(xué)特點是間充質(zhì)干細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化障礙，能夠直接生成骨或者骨樣組織，侵襲性強(qiáng)并且早期就易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。骨肉瘤的組織學(xué)分型為（傳統(tǒng)型，毛細(xì)血管擴(kuò)張型，骨旁骨肉瘤，骨膜骨肉瘤，低級中央，小細(xì)胞型）。最常見的為傳統(tǒng)型，按照細(xì)胞組織形態(tài)又分為：骨母細(xì)胞型、軟骨母細(xì)胞型、纖維母細(xì)胞型，此三型在臨床轉(zhuǎn)歸上沒有明顯差異。由于其惡

2、性程度高、侵襲性和轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，發(fā)病早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，易轉(zhuǎn)移到肺和骨，確診的患者5年生存率只有60%，10年生存率不超過30%。約15-25%的患者發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致化療失敗和不良預(yù)后。此外，近90%骨肉瘤患者有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，甚至是徹底的外科手術(shù)切除原發(fā)腫瘤后。尤其在發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中，5年生存率至今不足30%。
　　大多數(shù)原發(fā)性骨肉瘤的病因不明。細(xì)胞遺傳學(xué)研究顯示在原發(fā)性骨肉瘤患者體內(nèi)基因（包括很多染色體）發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化，其發(fā)生和

3、發(fā)展可能與這些基因的失調(diào)控有關(guān)，但是并沒有具體模式。因此，有必要找到骨肉瘤與正常組織間的差異表達(dá)基因，確定骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為抑制骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移探索新的治療方法。
　　底板反應(yīng)蛋白（SPON1），即F-spondin，一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，最初是從脊椎動物的胚胎底板分離出來。研究發(fā)現(xiàn)重組SPON1蛋白能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞粘著和神經(jīng)元生長，說明SPON1有調(diào)節(jié)胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長的作用。SPON1還能促進(jìn)血管平

4、滑肌細(xì)胞增殖并且抑制血管生成。除此之外，還發(fā)現(xiàn)SPON1在很多其他組織中有表達(dá)，如卵巢、胚胎生長板軟骨、牙周組織、骨關(guān)節(jié)炎軟骨。但是，SPON1在骨肉瘤組織中是否有表達(dá)，表達(dá)量如何，還不清楚。
　　基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組含有鋅離子和鈣離子依賴性內(nèi)肽蛋白水解酶，組成成員有20多個，主要作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)的一些重要的蛋白酶類，使細(xì)胞外基質(zhì)維持動態(tài)平衡。以往的很多研究證實MM

5、Ps家族在腫瘤的增殖、血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是MMPs家族中的重要一員，主要降解細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。
　　腫瘤增殖抗原Ki67參與多個細(xì)胞內(nèi)信號通路，是反映細(xì)胞增殖活性的敏感指標(biāo)，在增殖期細(xì)胞表達(dá)，而在靜止期細(xì)胞不表達(dá)，半衰期短，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象。
　　

6、著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的一種蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK），與細(xì)胞的粘附功能密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移時，整合素通過使異質(zhì)性黏附升高，同質(zhì)性黏附降低，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲。FAK是整合素信號通路中的關(guān)鍵分子，參與了腫瘤細(xì)胞的多個信號傳導(dǎo)途徑。
　　肉瘤激酶（sarcoma，Src）家族成員是由原癌基因編碼的位于細(xì)胞質(zhì)的非受體型酪氨酸蛋白激酶，

7、分子量為60kD，是第一個被發(fā)現(xiàn)具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)多條信號傳遞途徑。
　　本研究的目的是確定骨肉瘤中SPON1的表達(dá)模式和分子機(jī)制。我們用人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系(KHOS、KRIB）和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系（HOS、U2OS）進(jìn)行研究。并用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)證明SPON1、Fak、Src信號通路的作用機(jī)制。開展臨床骨肉瘤樣本SPON1的表達(dá)的免疫組化分析，研究SPON1水平分別和MMP9和Ki67表達(dá)的關(guān)系

8、。SPON1對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。最后，我們的研究表明，SPON1/Fak/Src相聯(lián)通路可能是控制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的一個有效途徑。
　　第一部分探討SPON1是否為人轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人非轉(zhuǎn)移性骨腫瘤的差異表達(dá)基因
　　目的：1確定4種骨肉瘤細(xì)胞系KHOS、KRIB、HOS、U2OS符合人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系的劃分，以便進(jìn)行下一步實驗。2確定從GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出的SPON1基因是人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤與人低轉(zhuǎn)移

9、性骨腫瘤間的一種差異基因。3探討高轉(zhuǎn)移性的人骨肉瘤標(biāo)本與低轉(zhuǎn)移性的人骨軟骨瘤標(biāo)本中SPON1表達(dá)是否存在差異，以及SPON1和兩種腫瘤標(biāo)志物MMP9、Ki67間的關(guān)系。
　　方法：
　　1 GEO數(shù)據(jù)庫高頻率突變基因附近核苷酸序列進(jìn)行GC%含量分析，同時選取高突變基因正常位點作為參照，尋找差異表達(dá)基因，并進(jìn)行分析。
　　2根據(jù)文獻(xiàn)選擇4種細(xì)胞系作為實驗對象，其中KHOS和KRIB為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系，HOS和U2O

10、S為人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系，并用細(xì)胞遷移及侵襲實驗驗證。
　　3用蛋白免疫印記實驗（Westernblot）檢測4種人骨腫瘤細(xì)胞系（人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS；人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS和KRIB）中SPON1蛋白表達(dá)及差異。
　　4免疫組織化學(xué)法檢測72例人骨肉瘤組織芯片和24例人骨軟骨瘤組織芯片中SPON1陽性表達(dá)率有無差異，組織芯片用二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。磷酸鹽緩沖液（PBS）中洗3遍后，在含有0.

11、01M檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液中微波加熱15分鐘，進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS沖洗后，組織切片用0.3%過氧化物酶滅活溶液封住內(nèi)源性過氧化物酶（封酶），然后分別用SPON1一抗，MMP9一抗和Ki67一抗孵育，4°C過夜。PBS洗3遍，切片用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗中溫育，加3，3’-二氨基聯(lián)苯胺磷酸鹽顯色。蘇木精復(fù)染。染色陽性的腫瘤細(xì)胞百分比來計算總的免疫染色評分。陽性百分比的分?jǐn)?shù)如下：0-10%為0分；10%-30%為1分；30%-60%為

12、2分；超過60%為3分。0-1分定義為低表達(dá)，2-3分定義為高表達(dá)。
　　結(jié)果：1 GEO數(shù)據(jù)庫（GSE49003）中高頻率突變基因附近核苷酸序列進(jìn)行GC%含量分析，同時選取高突變基因正常位點作為參照，得出SPON1可能為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人低轉(zhuǎn)移性骨腫瘤間的差異基因。2細(xì)胞遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，根據(jù)文獻(xiàn)選出的4種人骨肉瘤細(xì)胞系，其中KHOS和KRIB為人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系，HOS和U2OS為人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系，可以作為研

13、究人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實驗細(xì)胞系。3通過蛋白免疫印跡實驗在4種人骨肉瘤細(xì)胞系中均檢測到SPON1蛋白。但是和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS相比，在KHOS和KRIB兩種人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系中SPON1蛋白高表達(dá)。4免疫組織化學(xué)顯示，在轉(zhuǎn)移率高的人骨肉瘤標(biāo)本中SPON1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于轉(zhuǎn)移性低的人骨軟骨瘤標(biāo)本，表明SPON1和腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，用斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計分析得出，在人骨肉瘤標(biāo)本中SPON1和MMP9間

14、有顯著正相關(guān)(P<0.001，R=0.745)，而不是Ki67(P=0.359)。
　　第二部分探討SPON1在骨肉瘤細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用
　　目的：1研究SPON1蛋白在骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用。2在裸鼠動物模型上觀察異種移植腫瘤生長情況及SPON1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。
　　方法：
　　1 siRNA轉(zhuǎn)染，生長曲線及MTT方法測定細(xì)胞生長及增殖情況：
　　1.1根據(jù)siRNA設(shè)計原則，

15、體外構(gòu)建并合成2種沉默SPON1基因表達(dá)的siRNA-SPON1（si-SPON1-1、si-SPON1-2）和1種陰性對照siRNA（si-Ctrl）。通過脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS和KRIB，沉默細(xì)胞中SPON1基因；
　　1.2 Westernblot實驗檢驗干擾效率；
　　1.3生長曲線及MTT實驗檢測siRNA脂質(zhì)體載體特異性沉默SPON1基因?qū)HOS和KRIB細(xì)胞的生長和增殖情況有無影響；

16、r>　　1.4 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗檢測SPON1沉默后的人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS與KRIB細(xì)胞遷移與侵襲能力的變化。
　　2用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS：
　　2.1將人重組SPON1蛋白稀釋為5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L、50nmol/l，Westernblot實驗鑒定。
　　2.2 MTT法測定不同濃度（0nmol/L、10nmol/

17、L、50nmol/L）人重組SPON1蛋白對兩種細(xì)胞系的生長和增殖情況有無影響；
　　2.3 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗檢測不同濃度（0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L）人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系HOS與U2OS后，對兩種細(xì)胞的遷移與侵襲能力的影響。
　　3裸鼠體內(nèi)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移實驗：
　　收集siRNA-SPON1-1轉(zhuǎn)染的KHOS細(xì)胞和陰性對照si-Ctrl轉(zhuǎn)染的KHOS細(xì)胞，

18、制備細(xì)胞-基質(zhì)膠混合物，注入麻醉裸鼠的脛骨近端（n=5只/組）。接種后6周，收集原位腫瘤和鼠肺。稱重原位腫瘤，并在解剖立體顯微鏡下查數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的個數(shù)。最后，原位腫瘤及肺部轉(zhuǎn)移瘤用10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，5μm厚切片，HE染色。觀察異種移植腫瘤生長情況及SPON1在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果：1 Westernblot實驗結(jié)果顯示：兩種SPON1 siRNA(si-SPON1-1, si-SPON1-2)轉(zhuǎn)染

19、人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS和KRIB，特異性沉默了SPON1基因的表達(dá)，兩種細(xì)胞的SPON1蛋白表達(dá)明顯下降。2生長曲線實驗MTT實驗均表明siRNA脂質(zhì)體載體轉(zhuǎn)染特異性沉默SPON1基因?qū)HOS和KRIB細(xì)胞的生長和增殖情況無明顯影響（P>0.05）；不同濃度人重組SPON1蛋白培養(yǎng)對人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS的生長和增殖情況無明顯影響（P>0.05）。3與對照細(xì)胞比較，沉默SPON1基因降低人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系K

20、HOS和KRIB細(xì)胞分解細(xì)胞基質(zhì)并侵襲到下層小室的能力，遷移及侵襲到下層小室的細(xì)胞明顯減少。重組人SPON1蛋白促進(jìn)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS和U2OS細(xì)胞遷移和侵襲，并呈劑量依賴關(guān)系。4將沉默SPON1基因的KHOS細(xì)胞和未沉默SPON1基因的KHOS細(xì)胞接種于麻醉裸鼠的脛骨近端，接種后6周，收集原位腫瘤和鼠肺。病理切片確認(rèn)原位腫瘤為骨肉瘤，鼠肺腫瘤為骨肉瘤轉(zhuǎn)移瘤。結(jié)果顯示，在KHOS細(xì)胞中特異性沉默SPON1基因不影響異種移植腫瘤

21、生長，但是對照組（未沉默SPON1基因的KHOS細(xì)胞接種）鼠的肺轉(zhuǎn)移病灶均明顯多于SPON1敲除組。
　　第三部分探討骨肉瘤細(xì)胞中SPON1與FAK\Src信號通路關(guān)系
　　目的：研究SPON1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是否與FAK\Src信號通路有關(guān)
　　方法：
　　1蛋白免疫印跡實驗（Westernblot）檢測特異性沉默SPON1基因的人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系KHOS細(xì)胞中FAK、Src的磷酸化水平，再檢測用不同濃度

22、人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS細(xì)胞中的FAK、Src的磷酸化水平。
　　2為了進(jìn)一步證明FAK和Src在SPON1引起的轉(zhuǎn)移過程中的作用，用siRNA分別沉默兩種人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HKOS和KRIB細(xì)胞中FAK基因和Src基因后，對兩種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實驗。用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)已經(jīng)沉默F(xiàn)AK、Src基因的KHOS、KRIB細(xì)胞，觀察其遷移及侵襲能力情況。
　　結(jié)果：1在人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤H

23、KOS細(xì)胞，特異性沉默SPON1基因?qū)е翭AK和Src的磷酸化水平降低。用人重組SPON1培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系HOS細(xì)胞，F(xiàn)AK和Src的磷酸化水平升高，并呈劑量依賴性關(guān)系。說明人骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的高低與細(xì)胞內(nèi)SPON1、FAK、Src均有關(guān)，F(xiàn)AK和Src的磷酸化水平與SPON1有關(guān)。2在沉默F(xiàn)AK和Src基因的HKOS和KRIB細(xì)胞，遷移和侵襲能力明顯下降。用不同濃度人重組SPON1蛋白（0nmol/L、10nmol/L、50

24、nmol/L）培養(yǎng)已經(jīng)沉默F(xiàn)AK、Src基因的KHOS細(xì)胞，其遷移及侵襲能力無明顯改善。說明在HKOS和KRIB細(xì)胞，SPON1對骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲的增強(qiáng)作用由于沉默F(xiàn)AK和Src完全受阻。FAK/Src信號通路是SPON1增強(qiáng)骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中的眾多信號通路之一。
　　結(jié)論：
　　1 SPON1是人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系和人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系的差異表達(dá)基因，也是人轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和人非轉(zhuǎn)移性骨軟骨瘤間的差異表達(dá)基因，在骨肉瘤細(xì)

25、胞遷移侵襲過程中可能具有重要的調(diào)控作用。并且發(fā)現(xiàn)SPON1水平與原發(fā)腫瘤細(xì)胞的MMP9表達(dá)密切相關(guān)。
　　2在體內(nèi)或體外實驗中，通過沉默SPON1基因，使人高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移和侵襲行為得到顯著抑制；用人重組SPON1蛋白培養(yǎng)人低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯提高?；谶@一實驗結(jié)果，我們推測，SPON1可能是作為骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的一個調(diào)節(jié)因子來發(fā)揮作用。
　　3 SPON1蛋白可顯著提高FAK和SRc信