骨肉瘤患者血清蛋白質(zhì)組學及Oridonin-Grifolin誘導骨肉瘤細胞凋亡的分子機制.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分 骨肉瘤患者的血清蛋白質(zhì)組學研究 近二十年來實施的手術(shù)聯(lián)合大劑量化療，使骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)手術(shù)后五年生存率提高到60-70﹪，但許多患者在確診時或病程中已發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，給治療帶來很大困難。長期的診斷與治療研究顯示，找到骨肉瘤特異性生物標記物是早期診斷和提高療效的新途徑。蛋白質(zhì)組學在尋找生物標記物方面具有高通量，高效率。2-D DIGE是近年來發(fā)展的新蛋白質(zhì)組技術(shù)，通過內(nèi)標的

2、建立，大大減少了人為因素影響，可信度大幅提高。骨肉瘤患者血清2-D DIGE技術(shù)尚未建立，應用該技術(shù)尋找骨肉瘤患者血清中表達差異蛋白質(zhì)的研究，目前國內(nèi)外均未見報道。對OS患者血清進行蛋白組學研究，尋找患者血清中差異表達的蛋白質(zhì)，并與以往對OS的基因研究資料相結(jié)合，不僅有助于從分子水平認識OS的發(fā)生發(fā)展機制，也可以為OS的篩選和診斷提供有效的分子標記物，并有望為OS的防治提供新的分子靶點。 目的: 1．建立骨肉瘤患者血清雙

3、向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，為利用該技術(shù)研究骨肉瘤患者血清蛋白組變化奠定基礎(chǔ)。 2．建立OS的蛋白質(zhì)指紋(PMF)。 3．尋找骨肉瘤患者血清中表達差異的蛋白質(zhì)，探討這些蛋白在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為骨肉瘤的早期診斷和篩選提供潛在的分子標記物。 4．應用Western blot和ELISA方法，驗證質(zhì)譜鑒定結(jié)果的真實性、可靠性。 方法: 1．收集骨肉瘤患者和正常成人血清樣本各4例，血清經(jīng)PROT-

4、BA Kit試劑盒處理后，分別進行不同的CyDye染料交叉標記，然后依次進行雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳、圖像掃描，并用專用分析軟件DeCyderv6.0，比較各組樣本間蛋白點圖像差異，并評估該技術(shù)體系。 2．提取32例骨肉瘤患者及30例正常成人血清蛋白，用不同的CyDye染料交叉標記后，依次進行雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳以分離蛋白質(zhì)、圖像分析以尋找表達差異的蛋白點，對表達差異的蛋白點進行基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖譜

5、，檢索MASCOT、數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白。 3．用Western Blot和ELISA方法，對明顯的差異蛋白驗證。 結(jié)論： 1．成功建立了骨肉瘤患者血清雙向膠內(nèi)差異凝膠電泳技術(shù)體系，為研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展分子機制提供了一種有效手段。 2．2-D DIGE分析結(jié)果進行質(zhì)譜鑒定，PMF法成功鑒定出43個蛋白質(zhì)，從中篩選出屬于差異性蛋白質(zhì)43種。質(zhì)譜鑒定出43個骨肉瘤相關(guān)血清蛋白質(zhì)，18個蛋白質(zhì)點上調(diào)，25個蛋白質(zhì)點下

6、調(diào)，為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。 3．比較骨肉瘤和正常人血清蛋白質(zhì)2-D DIGE圖譜，初步確定了2個骨肉瘤上調(diào)血清蛋白點(SAA、CP)和1個骨肉瘤下調(diào)蛋白點(Gelsolin)與骨肉瘤發(fā)病和發(fā)展密切相關(guān)。SAA的血清含量在骨肉瘤患者化療前、后、術(shù)后以及復發(fā)等同治療階段均有變化。 第二部分 Grifolin/Oridonin誘導骨肉瘤細胞凋亡的分子機制 化療是治療骨肉瘤的三大手段之一，但目前傳統(tǒng)的化療藥物主要是細胞

7、毒藥物，不可避免地會影響正常細胞，帶來臨床上常見的各種不良反應。另一方面耐藥性的產(chǎn)生也限制了這類藥物在臨床上的應用。從天然物質(zhì)(尤其是中藥)中尋找毒副作用小、安全有效的抗腫瘤藥物成為近年的研究熱點。針對促凋亡作用和特定靶點的藥物研究是腫瘤化療藥物開發(fā)的主要方向之一。近幾年來，天然中草藥的抗癌作用靶點的研究成為近年來國內(nèi)外藥物研發(fā)的熱門。尋找靶點的抗腫瘤藥物研究具有廣闊的前景，但國外已開發(fā)的靶點(如Akt)特異性抗腫瘤候選化合物大多穩(wěn)定性

8、差，細胞通透性和溶解度不佳，目前仍處于臨床前期的研究。而本課題組在用體外生化檢測法篩選天然產(chǎn)物及其衍生物時發(fā)現(xiàn)，Grifolin(奇果菌素)和Oridonin(冬凌草甲素)在體外能明顯抑制Akt激酶的活性。Grifolin是從奇果菌分離出的多糖，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、殺菌、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用。Oridonin是冬凌草的主要有效成分，是從冬凌草中提取出來的一種以貝殼杉烯(ent-kaurene)為骨架的四環(huán)二萜類化合物，大量資料證明

9、它對多種腫瘤均具有明顯的抑制作用，其對實體瘤如食道癌、肝癌等的治療已廣泛應用于臨床，并取得了明顯的療效。 目的: 本研究分別探討Grifolin和Oridonin對兩種骨肉瘤細胞(U20S和MG63細胞)凋亡及其作用機制，以及對Akt活性抑制作用，骨肉瘤細胞內(nèi)對Akt磷酸化的影響和Akt下游靶分子的影響研究，為這些藥物的研究、開發(fā)和臨床應用提供理論和實驗依據(jù)。 方法: 1．MTT法測定Grifolin和O

10、ridonin對細胞存活率的影響。 2．Hoechst33258染色和流式細胞術(shù)，分別檢測Grifolin和Oridonin處理后細胞形態(tài)學改變和DNA含量的變化，線粒體膜電位變化，對細胞色素C的釋放影響。 3．采用Western Blot檢測，分析相關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化水平變化。 4．統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)用6次獨立實驗的平均值表示，結(jié)果進行t檢驗、方差分析，用SPSS 14.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分

11、析。 結(jié)論： 1、Grifolin和Oridonin均能抑制骨肉瘤細胞U2OS和MG63增殖，并誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。 2、通過實驗證明，Grifolin和Oridonin能在體外抑制Akt的活性。Grifolin和Oridonin在細胞內(nèi)通過抑制Akt的活性及其下游信號途徑誘導腫瘤細胞凋亡。 3、Oridonin有可能影響MAPKs通路來誘導腫瘤細胞凋亡。 4、Grifolin和Oridonin