靶向Survivin基因?qū)侨饬黾?xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：骨肉瘤為最常見(jiàn)的原發(fā)于骨組織的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，預(yù)后較差。Survivin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族的一個(gè)新成員。那么Survivin在骨肉瘤組織和細(xì)胞中是否呈高表達(dá)，且其表達(dá)程度是否與骨肉瘤的惡性程度及侵襲能力相關(guān)?在本文中通過(guò)免疫組化研究了Survivin，Cox-2在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況，初步探討其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，明確其在骨肉瘤病理診斷中的意義。 第一部分：凋亡抑制蛋白Survivi

2、n在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其與Cox-2表達(dá)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究 論文1骨肉瘤組織中Survivin，Cox-2的表達(dá)及其意義 目的：研究Survivin，Cox-2在骨肉瘤中的表達(dá)情況，初步探討其在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，明確其在骨肉瘤病理診斷中的意義。方法：應(yīng)用免疫組化SP法，檢測(cè)38例骨肉瘤組織的臨床標(biāo)本及20例骨軟骨瘤組織中Survivin，Cox-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)在65.8％的骨肉瘤組織中Survivin的

3、表達(dá)陽(yáng)性，骨軟骨瘤組織的表達(dá)率為20.0％(P＜0.01)。57.9％的骨肉瘤組織表達(dá)Cox-2陽(yáng)性，顯著高于骨軟骨瘤組織的表達(dá)率(25.0％)(P＜0.05)。在組織切片中Survivin、Cox-2陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)為胞漿或胞膜染為棕黃色。Survivin、Cox-2在骨肉瘤中表達(dá)顯著高于其在骨軟骨瘤中的表達(dá)，且其表達(dá)率的高低與骨肉瘤的分化程度和臨床分期密切相關(guān)。Survivin表達(dá)上調(diào)和Cox-2表達(dá)上調(diào)與骨肉瘤的臨床分期密切相關(guān)，S

4、urvivin的表達(dá)與Cox-2的表達(dá)密切相關(guān)。結(jié)論：在骨肉瘤組織中Survivin、Cox-2的表達(dá)異常，提示它們可能對(duì)骨肉瘤的發(fā)展起重要作用。 論文2NS-398對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及其對(duì)Survivin表達(dá)的影響 目的：觀察選擇性的環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的凋亡的影響及其對(duì)Survivin基因表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，應(yīng)用MTT法研究不同濃度NS-398對(duì)骨肉瘤

5、細(xì)胞系MG-63的凋亡誘導(dǎo)作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，RT-PCR法分析NS-398對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中Survivin基因表達(dá)的影響。結(jié)果：NS-398可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63發(fā)生凋亡，并具有劑量依賴(lài)性，在NS-398濃度為200μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示NS-398引起MG-63細(xì)胞凋亡率增加。RT-PCR分析顯示經(jīng)NS-398作用后的骨肉瘤細(xì)胞系MG-63表達(dá)Survivin

6、較用藥前明顯下降。結(jié)論：NS-398對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63有殺傷作用，其作用可能通過(guò)抑制Survivin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。 第二部分Survivin反義寡核苷酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及其機(jī)制 論文1Survivin反義寡核苷酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 目的：采用合成的Survivin反義寡核苷酸(ASODN)作用于骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，觀察其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63增殖和凋亡的影響。方法：以脂質(zhì)

7、體為載體，介導(dǎo)不同濃度Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染于人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，應(yīng)用MTT法和形態(tài)學(xué)檢測(cè)研究不同濃度Survivin反義寡核苷酸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63的生長(zhǎng)抑制作用，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸后的細(xì)胞凋亡率，Hochest33258熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，DNAladder檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：脂質(zhì)體介導(dǎo)Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG-63后，可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG-63發(fā)生凋

8、亡，不同濃度的ASODN引起的凋亡率不同，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，其中以600nmol/L的ASODN轉(zhuǎn)染組抑制作用最顯著。DNAladder檢測(cè)發(fā)現(xiàn)典型的DNA梯形。形態(tài)學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ASODN轉(zhuǎn)染后細(xì)胞發(fā)生凋亡、增殖發(fā)生抑制。結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸可以有效抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 論文2Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Survivin、fas基因表達(dá)的影響 目的：采用合成的Surv

9、ivin反義寡核苷酸(ASODN)封閉骨肉瘤細(xì)胞Survivin的作用，觀察其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系MG-63Survivin及Fas基因表達(dá)的影響。方法：以脂質(zhì)體為載體，介導(dǎo)Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染于人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63，半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸后的骨肉瘤細(xì)胞SurvivinmRNA表達(dá)和FasmRNA表達(dá)的變化，Western-blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸后的骨肉瘤細(xì)胞Survi

10、vin蛋白和Fas蛋白的變化。結(jié)果：脂質(zhì)體介導(dǎo)Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系MG-63后，骨肉瘤細(xì)胞Survivin蛋白及mRNA表達(dá)均明顯降低，而Fas蛋白和mRNA表達(dá)均明顯增高。結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸可以有效降低細(xì)胞內(nèi)Survivin基因的蛋白和mRNA的表達(dá)并提高Fas基因蛋白和mRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 第三部分Survivin反義核酸載體的構(gòu)建及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、侵襲

11、能力的影響 論文1反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建人Survivin基因的反義真核表達(dá)載體并鑒定，特異性的封閉人骨肉瘤細(xì)胞MG-63中Survivin基因的表達(dá)，觀察SurvivinmRNA的表達(dá)變化。方法：采用RT-PCR的方法，從人骨肉瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出459bp的Survivin基因的cDNA片段，經(jīng)T載體克隆后以BamHI和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)雙酶切，定向克隆到真核表達(dá)載體

12、pEGFP-C1中，構(gòu)建成反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切分析及測(cè)序鑒定。通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后SurvivinmRNA的表達(dá)變化。結(jié)果：成功構(gòu)建出了反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體并經(jīng)鑒定正確，轉(zhuǎn)染反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)質(zhì)粒后骨肉瘤細(xì)胞的SurvivinmRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯降低。結(jié)論：反義pEG

13、FP-C1-Survivin真核表達(dá)載體在人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63中發(fā)揮了特異性的封閉作用。為進(jìn)一步研究Survivin的分子生物學(xué)特性及致瘤機(jī)理及今后利用反義Survivin核酸載體治療骨肉瘤提供了實(shí)驗(yàn)和理論模型。 論文2反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：觀察Survivin反義核酸載體對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63生物學(xué)行為的抑制效應(yīng)，并初步探討其相關(guān)機(jī)制。方法：反義p

14、EGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入MG-63細(xì)胞中。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后增殖能力的變化，Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染前后侵襲能力的變化。RT-PCR和Westernblot分析轉(zhuǎn)染前后Ang-2基因mRNA和蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞株MG-63中，并經(jīng)穩(wěn)定篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。MTT檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細(xì)胞的增殖明顯受抑制，轉(zhuǎn)染組與其他各組之

15、間有顯著性差異(P＜0.01)，脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組和空白組之間差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。RT-PCR和Westernblot分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義pEGFP-C1-Survivin真核表達(dá)載體后，MG-63Ang-2基因mRNA和蛋白的表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯下降，與空白組、脂質(zhì)體組和空質(zhì)粒組之間有顯著差異(P＜0.01)，而另三組之間差異不顯著(P＞0.05)。Boyden小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)測(cè)定侵襲能力顯示轉(zhuǎn)染組侵襲能力明顯下降。與其他各組間