miR-183在人骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)及其對骨肉瘤轉(zhuǎn)移能力影響的初步實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　骨肉瘤是青少年中最常見的原發(fā)于骨的的惡性腫瘤,骨肉瘤具有很高的全身轉(zhuǎn)移的傾向,大約20％的患者在初次診斷的時候已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,另外還有40%的患者晚期發(fā)生遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移。隨著化療藥物的出現(xiàn)和應(yīng)用,目前骨肉瘤患者的5年生存率已由上世紀(jì)70年代之前的10-20%上升至現(xiàn)在的60-80%。但是無論是原發(fā)性骨肉瘤還是轉(zhuǎn)移性骨肉瘤,對常規(guī)的化療藥物都具有耐藥性,腫瘤耐藥是骨肉瘤患者保肢手術(shù)治療失敗及發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要原因,

2、而腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是骨肉瘤患者死亡的主要原因。
　　轉(zhuǎn)移性腫瘤對治療不敏感的主要原因是藥物抵抗。研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)出了和原發(fā)性腫瘤細(xì)胞完全不同的生物學(xué)特性,發(fā)生轉(zhuǎn)移后的腫瘤細(xì)胞群在細(xì)胞的倍增速度、酶表達(dá)譜、染色體組型和化療藥物的敏感性方面都不同于其原發(fā)的腫瘤細(xì)胞群。這就解釋清楚了對原發(fā)腫瘤有效的化療方案,為什么卻對轉(zhuǎn)移性腫瘤絲毫不起作用。
　　惡性腫瘤最后在人體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移病灶需要經(jīng)過很多重要的步驟。要能夠從分子

3、水平上控制腫瘤的轉(zhuǎn)移,首先需要對腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制有徹底的認(rèn)識,通過控制腫瘤轉(zhuǎn)移的各個步驟,進(jìn)而防止腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。盡管經(jīng)過的大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗,骨肉瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制仍然不是很清楚。對骨肉瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行徹底研究將會為治療骨肉瘤提供革命性的理論基礎(chǔ)。
　　microRNA作為基因的一種表現(xiàn)形式,是否在骨肉瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮作用以及以何種形式發(fā)揮作用,引起了學(xué)者的關(guān)注。因此,本實驗旨在通過比較高、低不同轉(zhuǎn)移能力的骨肉瘤細(xì)胞中m

4、icroRNA的表達(dá)水平的差異,并通過瞬時轉(zhuǎn)染microRNA的方法對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),觀察干預(yù)后腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移特性,以探索瞬時轉(zhuǎn)染microRNA對骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的即刻效應(yīng),為更好的明確骨肉瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制提供理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　首先比較高、低轉(zhuǎn)移能力骨肉瘤細(xì)胞中miR-183及Ezrin蛋白的表達(dá)差異,根據(jù)表達(dá)水平的差別對骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性miR-183,建立不同表達(dá)水平miR-183的骨肉瘤

5、細(xì)胞模型。然后采用MTT、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實驗、transwell實驗、免疫細(xì)胞化學(xué)、western bloting等實驗方法對細(xì)胞的生長特性和形態(tài)學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行研究,以評估m(xù)iR-183在不同轉(zhuǎn)移能力細(xì)胞中的表達(dá),miR-183對細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的影響和細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。最后通過相關(guān)的統(tǒng)計學(xué)分析,以明確miR-183表達(dá)水平與Ezrin蛋白的表達(dá)量、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力之間的相關(guān)性。
　　研究結(jié)果:
　　1.無論是在骨肉

6、瘤細(xì)胞還是在骨肉瘤組織中,高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中Ezrin蛋白的表達(dá)量高于低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中的表達(dá);而實時定量PCR研究發(fā)現(xiàn),高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞中miR-183的表達(dá)量顯著低于高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中的表達(dá)量。
　　2.通過瞬時轉(zhuǎn)染外源性miR-183可以使高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞F5M2中miR-183的表達(dá)量顯著升高,成功建立不同表達(dá)水平miR-183的骨肉瘤細(xì)胞模型。
　　3. MTT、流式細(xì)胞儀、細(xì)胞劃痕實驗、transwell等實驗結(jié)果表

7、明外源性過表達(dá)miR-183的F5M2細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著下降,呈劑量依賴關(guān)系;miR-183對F5M2細(xì)胞的增殖和凋亡能力無影響。
　　4.免疫細(xì)胞化學(xué)、western bloting等實驗結(jié)果表明外源性過表達(dá)miR-183的F5M2細(xì)胞中Ezrin蛋白的表達(dá)量下降,呈劑量依賴關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤細(xì)胞F5M2中miR-183的表達(dá)量較低轉(zhuǎn)移性骨肉瘤F4中表達(dá)量較低,而高轉(zhuǎn)移性腫瘤中Ezrin蛋白的表達(dá)量

8、顯著高于低轉(zhuǎn)移性腫瘤。通過轉(zhuǎn)染外源性miR-183可以顯著提高miR-183在F5M2的表達(dá)量,降低Ezrin蛋白表達(dá)。miR-183的表達(dá)量提高不僅會使F5M2中Ezrin蛋白的表達(dá)量降低,而且可以使腫瘤的侵襲和遷移能力顯著抑制,而增殖和凋亡特性無明顯變化。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn),Ezrin蛋白的表達(dá)量和骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能存在正相關(guān)。這些研究結(jié)果提示通過提高miR-183在高轉(zhuǎn)移性骨肉瘤F5M2中的表達(dá)量,可以抑制Ezrin蛋白的表達(dá),從而