微應(yīng)變環(huán)境對(duì)組織工程化周圍神經(jīng)功能恢復(fù)的影響.pdf

1、目的：
　　1.采用低滲聯(lián)合凍干技術(shù)改良脫細(xì)胞神經(jīng)支架制作方法，并在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上改良兔SCs分離純化方法，將所得的神經(jīng)支架和SCs于體外構(gòu)建新型組織工程化周圍神經(jīng)。
　　2.對(duì)體外構(gòu)建的新型組織工程化周圍神經(jīng)給予不同程度的微應(yīng)變牽張刺激，通過(guò)顯微縫合技術(shù)植入周圍神經(jīng)缺損動(dòng)物模型體內(nèi)，檢測(cè)其神經(jīng)功能恢復(fù)情況及種子細(xì)胞在體內(nèi)的分子生物學(xué)變化。
　　方法：
　　1.在傳統(tǒng)化學(xué)脫細(xì)胞神經(jīng)支架制作方法基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行低滲

2、和冷凍干燥處理，并進(jìn)行HE染色和掃描電鏡檢測(cè)，觀察脫細(xì)胞是否完全。綜合多種SCs分離純化方法，通過(guò)酶消化法獲得混有成纖維細(xì)胞的原代SCs，利用抗代謝藥物Ara-C抑制成纖維細(xì)胞的增殖，HRG1-β1修復(fù)并刺激初次純化后的SCs，再結(jié)合差速酶法和差速貼壁法對(duì)其進(jìn)一步純化。用PKH26熒光示蹤劑對(duì)所得的高純度SCs進(jìn)行標(biāo)記，在體式顯微鏡下通過(guò)顯微注射的方法于體外構(gòu)建新型組織工程化周圍神經(jīng)，并進(jìn)行HE染色觀察SCs在支架內(nèi)的生長(zhǎng)狀況。

3、　　2．將前期體外構(gòu)建的新型組織工程化周圍神經(jīng)置于 BioDynamic生物反應(yīng)艙系統(tǒng)內(nèi)通過(guò)EF3200生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀對(duì)其進(jìn)行不同程度的周期性循環(huán)牽張微應(yīng)變刺激（形變量分別為0％、5%、10%和15%）。通過(guò)顯微縫合技術(shù)將不同形變量刺激后的神經(jīng)支架植入坐骨神經(jīng)缺損動(dòng)物模型（缺損長(zhǎng)度1cm）體內(nèi)修復(fù)神經(jīng)缺損。分別于4周和8周通過(guò)超聲觀察支架在體內(nèi)的形態(tài)變化和連續(xù)性，于8周時(shí)，檢測(cè)動(dòng)物模型術(shù)側(cè)神經(jīng)電生理和腓腸肌恢復(fù)情況，并取出神經(jīng)支架進(jìn)行H

4、E、甲苯胺藍(lán)染色，觀察支架內(nèi)細(xì)胞分布及髓鞘計(jì)數(shù)；S-100、GFAP及NF-200免疫熒光染色并測(cè)IOD值。病理切片后觀察遠(yuǎn)端吻合口PKH26熒光示蹤情況。
　　結(jié)果：
　　1.改良后的脫細(xì)胞神經(jīng)支架HE染色及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示支架內(nèi)部髓鞘及SCs均被完全去除，支架內(nèi)部存在豐富的孔狀結(jié)構(gòu)。綜合多種SCs分離純化方法可以快速獲得大量增殖活性好的高純度雪旺細(xì)胞。HE染色結(jié)果顯示SCs在改良支架內(nèi)存活良好。
　　2.在不同

5、微應(yīng)變環(huán)境下四組不同形變量刺激的神經(jīng)支架的超聲長(zhǎng)軸圖像可見(jiàn)各組吻合口處神經(jīng)外膜平滑延續(xù)，無(wú)斷離發(fā)生，短軸圖像可見(jiàn)神經(jīng)纖維束的結(jié)構(gòu)清晰完整。肌電圖檢測(cè)結(jié)果中10%形變量刺激后的神經(jīng)支架NCV明顯高于其余三種形變量組，且0%、5%、15%形變量刺激組肌電圖上可見(jiàn)低電壓、多相位的新生電位，10%形變量刺激組可見(jiàn)短時(shí)程、高波幅的再生電位。10%形變量組雙側(cè)腓腸肌濕重比明顯高于其余三種形變量組。
　　植入體內(nèi)的支架8周時(shí)除15%形變量組結(jié)構(gòu)

6、崩解外，0%、5%、10%組支架內(nèi)部及自體移植組基底層和神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)完整，呈波浪狀分布。10%形變量組髓鞘數(shù)目高于0%、5%組，低于自體神經(jīng)移植組。10%形變量組S-100及GFAP免疫熒光染色I(xiàn)OD值明顯高于0%、5%和自體神經(jīng)移植組，低于空白對(duì)照組，NF-200免疫熒光染色I(xiàn)OD值高于0%和5%組，低于自體神經(jīng)移植組和空白對(duì)照組。0%、5%及10%形變量組8周時(shí)遠(yuǎn)端吻合口均可見(jiàn)PKH26紅色熒光，15%組呈陰性。
　　結(jié)論：<