基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞結(jié)合組織工程材料治療周圍神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、神經(jīng)損傷的再生修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)和焦點(diǎn)。目前的研究表明，周圍神經(jīng)損傷后雖有一定的自我再生能力，但良好的再生修復(fù)更需要神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTFs)、基質(zhì)和神經(jīng)細(xì)胞這三方面因素的協(xié)同作用來實(shí)現(xiàn)。 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫組織(細(xì)胞)化學(xué)技術(shù)、HRP逆行示蹤、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，膜片鉗電生理技術(shù)等方法，分離、培養(yǎng)大鼠大腦皮層NSCs，觀察NSCs與殼聚糖、雪旺細(xì)胞(Schwann'scells，SC

2、s)共培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)、分化的情況。并將GDNF基因在體外轉(zhuǎn)染到NSCs中，篩選、擴(kuò)增后移植到經(jīng)過殼聚糖管套接的大鼠坐骨神經(jīng)離斷模型中，以滿足神經(jīng)再生修復(fù)的三大因素，觀察評(píng)價(jià)治療效果，為損傷神經(jīng)的治療探索新的可行性。主要結(jié)果如下： 1.本實(shí)驗(yàn)分離、培養(yǎng)胚胎大鼠大腦皮層NSCs。細(xì)胞呈球狀懸浮生長(zhǎng)，細(xì)胞克隆傳代至8～9代仍具有干細(xì)胞特性。細(xì)胞克隆經(jīng)NSCs特異性標(biāo)記物Nestin抗體免疫熒光標(biāo)記后，呈強(qiáng)陽(yáng)性。經(jīng)10％FBS誘導(dǎo)后，在

3、干細(xì)胞團(tuán)周圍可見大量的、不同形態(tài)增殖的新生細(xì)胞，呈放射狀向外遷移、增殖。分化的細(xì)胞分別呈Anti-GFAP及Anti-MAP2反應(yīng)陽(yáng)性。 2.將NSCs種植在殼聚糖膜上的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分NSCs細(xì)胞球以底部粘于殼聚糖膜上，但仍保持球形生長(zhǎng)。在相同生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)上，殼聚糖膜上的神經(jīng)球數(shù)目和神經(jīng)球的直徑與正常對(duì)照組無顯著差別。說明殼聚糖膜與NSCs有較好的組織相容性，NSCs在殼聚糖膜上不會(huì)影響其生長(zhǎng)，NSCs仍然保持原有的特性。

4、 3.生長(zhǎng)于殼聚糖膜上的NSCs，經(jīng)FBS誘導(dǎo)后同樣可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組比較，生長(zhǎng)于殼聚糖膜上的NSCs更容易分化，表現(xiàn)為分化時(shí)間更早，分化出的細(xì)胞更多。通過Anti-GFAP、Anti-MAP2免疫組化染色后的圖像分析顯示，殼聚糖膜上生長(zhǎng)的NSCs分化出的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元均明顯多于對(duì)照組。說明殼聚糖更加適宜NSCs的分化。 4.將NSCs與SCs共同培養(yǎng)后觀察到NSCs的分化現(xiàn)象。與自然誘導(dǎo)分化的對(duì)照組比較

5、，共培養(yǎng)組分化細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組，其中Anti-MAP2染色陽(yáng)性神經(jīng)元樣細(xì)胞的百分率明顯高于對(duì)照組。表明SCs能促進(jìn)NSCs的存活和分化，更能促進(jìn)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。 5.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，結(jié)果顯示在殼聚糖膜上誘導(dǎo)分化組以及與SCs共培養(yǎng)組中，Anti-MAP2陽(yáng)性的神經(jīng)元百分比均較自然分化組顯著增高。同時(shí)，與SCs共培養(yǎng)的NSCs分化的Anti-MAP2陽(yáng)性細(xì)胞百分比也較殼聚糖膜上誘導(dǎo)分化組顯著增高。 6.本

6、實(shí)驗(yàn)利用含有大鼠GDNF的cDNA序列基因的pGDNF3a質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、抽提和純化，并酶切鑒定后與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN重組，構(gòu)建了pLXSN-GDNF重組體，分別以pGDNF3a、pLXSN-GDNF及pLXSN質(zhì)粒DNA為模板，用GDNF特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出長(zhǎng)度為0.66kb的GDNF基因片段，符合理論大小。 7.用pLXSN-GDNF逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體感染培養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛的NSCs，G418篩選后，這些基因

7、工程化細(xì)胞經(jīng)10代左右的培養(yǎng)后，仍能形成懸浮生長(zhǎng)、具有較強(qiáng)活性的細(xì)胞克隆。經(jīng)誘導(dǎo)分化，NSCs克隆仍可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。且這些分化細(xì)胞也有較強(qiáng)GDNF基因的表達(dá)。 8.基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Anti-GDNF免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，有60～80％的NSCs感染了pLXSN-GDNF。誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞也呈Anti-GDNF免疫陽(yáng)性反應(yīng)。提取細(xì)胞總RNA行RT-PCR鑒定，也擴(kuò)增出長(zhǎng)度為0.66kb的GDNF基因片段，符合理論大

8、小。 9.聯(lián)合NSCs/GDNF-NSCs和殼聚糖套管治療，能減少大鼠損傷側(cè)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡率，提高了神經(jīng)元的存活率，促進(jìn)損傷神經(jīng)元胞體逆行軸漿運(yùn)輸及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)等的恢復(fù)，同時(shí)有利于新生神經(jīng)纖維髓鞘的形成。且GDNF-NSCs效果優(yōu)于NSCs。說明該治療對(duì)外周神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的脊髓神經(jīng)元死亡和退行性變有較好的保護(hù)作用，并對(duì)外周神經(jīng)損傷后新生神經(jīng)功能的恢復(fù)具有積極的促進(jìn)作用。 l0.膜片鉗全細(xì)胞記錄脊髓前角神經(jīng)元基本

9、膜電生理特性顯示，神經(jīng)元被動(dòng)膜電生理特性無顯著變化；NSCs組與GDNF-NSCs組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢婚撝?、時(shí)程與對(duì)照組比較存在顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，在坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，表現(xiàn)為產(chǎn)生動(dòng)作電位的閾值降低、時(shí)程增長(zhǎng)。通過移植NSCs和GDNF-NSCs治療后這些指標(biāo)較SAL組顯著變化——更接近于未損傷的正常值，而且GDNF-NSCs組更優(yōu)于NSCs組。 總之，通過我們的實(shí)驗(yàn)，聯(lián)合應(yīng)用基因工程細(xì)胞和組織工程材料治療大鼠坐骨