組織工程化牙根組織的研究.pdf

1、牙齒依靠牙根固定在牙槽骨中。牙根由牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體、牙骨質(zhì)構(gòu)成； 牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體占據(jù)牙根的主體，而牙周膜通過(guò)牙骨質(zhì)緊密地附著在牙本質(zhì)表面。具有一定形態(tài)的組織工程化牙根結(jié)合傳統(tǒng)樁冠將有可能成為新的治療牙齒缺失的手段；同時(shí)，利用組織工程化牙根組織的方法也有助于改善傳統(tǒng)種植體與牙槽骨的生物界面。 牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的解剖生理學(xué)特點(diǎn)決定了組織工程化牙本質(zhì)的研究方法。成牙本質(zhì)細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，其前體細(xì)胞性質(zhì)不明，如何有效地趨

2、化和誘導(dǎo)其分化為功能性的成牙本質(zhì)細(xì)胞？采取什么策略組織工程化具有一定形狀和大小的牙本質(zhì)？組織工程化牙髓中細(xì)胞外基質(zhì)的改變對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成有何影響？如果獲得了牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體，如何在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步組織工程化牙根組織？牙本質(zhì)能否誘導(dǎo)牙骨質(zhì)、牙周膜在其表面形成？ 針對(duì)這些問(wèn)題我們進(jìn)行了下列四方面研究： 第一部分：利用不同支架材料離體誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究 本實(shí)驗(yàn)采用牙乳頭離體培養(yǎng)方法比較了微孔濾

3、膜（復(fù)合或者不復(fù)合TGF-β1））、PLA（復(fù)合或者不復(fù)合TGF-β1）誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的能力。結(jié)果顯示結(jié)合有TGF-β1 的微孔濾膜能夠有效地趨化成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞并誘導(dǎo)其分化，培養(yǎng)8 d 后，與微孔濾膜接觸的牙乳頭細(xì)胞高柱狀分化并有極性分泌現(xiàn)象；免疫組織化學(xué)和RT－PCR 檢測(cè)顯示細(xì)胞表達(dá)DSP、OPN、Col I、DSPP、DMP1 等成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性表型；透射電鏡檢測(cè)顯示細(xì)胞極化、分泌功能活躍，與成牙本質(zhì)細(xì)胞特點(diǎn)一

4、致。而對(duì)照PLA 組沒(méi)有觀察到極化的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。研究結(jié)果說(shuō)明，生長(zhǎng)因子及其呈遞模式在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化中起著重要的作用，設(shè)計(jì)誘導(dǎo)牙本質(zhì)形成的支架材料時(shí)應(yīng)該予以充分考慮。 第二部分：組織工程化具有一定形狀與大小的牙本質(zhì)的可行性研究 人工控制組織工程化牙本質(zhì)的形狀與大小具有重要意義。我們假設(shè)如果一種支架材料能夠趨化并誘導(dǎo)組織工程化牙髓中的成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞在其表面分化成為功能性的成牙本質(zhì)細(xì)胞，隨后這些成牙本質(zhì)細(xì)胞分

5、泌和形成特異性的管狀牙本質(zhì)，而且這種細(xì)胞學(xué)反應(yīng)和組織生成過(guò)程能夠均勻地發(fā)生，那么所生成的牙本質(zhì)的形態(tài)就能夠大體上受支架材料的控制。為此我們將結(jié)合有TGF-β1的微孔濾膜植入牙乳頭中培養(yǎng)，4d后微孔濾膜能夠誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，透射電鏡檢測(cè)顯示極化細(xì)胞具有分泌功能活躍的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)；7d后極化細(xì)胞高柱狀更加明顯；20d后有管狀牙本質(zhì)形成；30d后牙本質(zhì)厚度均一增加。免疫組化證明誘導(dǎo)形成的成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)DSP、OPN、Col I等特異性標(biāo)

6、記；統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示4 d、7 d、20 d 和30 d 的細(xì)胞學(xué)反應(yīng)和組織形成過(guò)程能夠在比較大的范圍內(nèi)均一的發(fā)生。研究結(jié)果證明了先前提出的控制組織工程化牙本質(zhì)形狀與大小的策略具有一定的可行性。 第三部分：組織工程化牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體的研究 為了研究不同胞外基質(zhì)環(huán)境對(duì)組織工程化牙髓組織的影響，我們?cè)囵B(yǎng)了SD 大鼠牙乳頭細(xì)胞，然后分別利用離心的牙乳頭細(xì)胞團(tuán)、牙乳頭細(xì)胞加膠原組織來(lái)工程化牙髓組織，并以牙乳頭作為對(duì)照；將組織工程

7、化的牙髓移植到大鼠腎臟被膜下30 d 后進(jìn)行HE 檢測(cè)。結(jié)果顯示，移植30 d 后，對(duì)照組中牙乳頭外周形成規(guī)則的管狀牙本質(zhì)，內(nèi)部為疏松結(jié)締組織，沒(méi)有散在的礦化組織形成；牙乳頭細(xì)胞團(tuán)組中，管狀牙本質(zhì)團(tuán)塊分散在牙髓組織中，數(shù)量較多，同時(shí)牙髓中還分布著骨樣礦化基質(zhì)；牙乳頭細(xì)胞加膠原組中可見(jiàn)大量的骨樣礦化基質(zhì)與未吸收的膠原構(gòu)成的礦化組織團(tuán)塊。研究結(jié)果表明胞外基質(zhì)環(huán)境對(duì)牙髓種子細(xì)胞表型維持和分化具有重要影響，應(yīng)該參照牙髓組織細(xì)胞外基質(zhì)設(shè)計(jì)仿生支架

8、材料。 為了進(jìn)一步研究結(jié)合有TGF-β1 的微孔濾膜誘導(dǎo)組織工程化牙髓形成牙本質(zhì)的能力，我們?cè)O(shè)計(jì)了牙乳頭加復(fù)合有TGF-β1 的微孔濾膜組，牙乳頭細(xì)胞加復(fù)合TGF-β1 的微孔濾膜組，牙乳頭細(xì)胞加復(fù)合TGF-β1 的微孔濾膜、膠原組，將種植體移植到SD 大鼠腎臟被膜下7 d、30 d 后取材。HE 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牙乳頭加復(fù)合TGF-β1 的微孔濾膜組移植7 d 后有規(guī)則的成牙本質(zhì)細(xì)胞沿著微孔濾膜分布，移植30 d 后沿著微孔濾膜形成

9、了管狀牙本質(zhì)，牙髓中很少見(jiàn)到散在礦化組織；牙乳頭細(xì)胞加復(fù)合TGF-β1 的微孔濾膜組移植7 d 后有比較分散的成牙本質(zhì)細(xì)胞沿著微孔濾膜分布，移植30 d 后沿著微孔濾膜形成了管狀牙本質(zhì)，但是牙髓中可見(jiàn)散在大量礦化組織；牙乳頭細(xì)胞加復(fù)合TGF-β1 的微孔濾膜、膠原組移植7 d 后有分散的高柱狀細(xì)胞沿著微孔濾膜分布，移植30 d 后沒(méi)有管狀牙本質(zhì)沿著微孔濾膜沉積，牙髓中彌散著大量骨樣礦化組織。 研究結(jié)果表明復(fù)合TGF-β1 的微

10、孔濾膜能夠誘導(dǎo)組織工程化牙髓分化成牙本質(zhì)細(xì)胞和分泌管狀牙本質(zhì)，但是這種反應(yīng)受到組織工程化牙髓中種子細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的影響。 第四部分：組織工程化牙根樣組織的研究 為了驗(yàn)證組織工程化牙本質(zhì)能否誘導(dǎo)牙骨質(zhì)和牙周膜形成，并組織工程化牙根組織，我們首先原代培養(yǎng)了人牙周膜細(xì)胞，利用第二部分研究中的方法組織工程化牙本質(zhì)，然后剝離微孔濾膜暴露牙本質(zhì)，將人牙周膜細(xì)胞復(fù)合在牙本質(zhì)表面后移植到裸鼠皮下20 d，取材觀察。結(jié)果顯示，

11、牙周膜細(xì)胞能夠在組織工程化牙本質(zhì)表面形成致密的膠原纖維束并垂直牙本質(zhì)表面排列，掃描電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在膠原纖維束和牙本質(zhì)之間有牙骨質(zhì)樣組織形成。新形成的牙周組織和牙本質(zhì)共同構(gòu)成了牙根組織。研究結(jié)果表明牙本質(zhì)能夠誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞在其表面形成包括類似牙周韌帶和牙骨質(zhì)的牙周組織，這可能與牙本質(zhì)中存在的大量生長(zhǎng)因子和其表面特性有關(guān)。 綜上所述，生長(zhǎng)因子及其空間呈遞模式在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中有著重要作用，在設(shè)計(jì)誘導(dǎo)牙本質(zhì)形成的支架材料時(shí)要予以

12、考慮，結(jié)合有TGF-β1的微孔濾膜能夠趨化和誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞在其表面分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞。同時(shí)成牙本質(zhì)細(xì)胞在微孔濾膜表面的分化過(guò)程和牙本質(zhì)形成過(guò)程具有均一性，使得人工控制組織工程化牙本質(zhì)的形狀和大小具有了可行性。組織工程化牙髓中的支架材料對(duì)種子細(xì)胞的生物學(xué)特性以及成牙本質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的遷移有重要影響，進(jìn)而能夠影響牙本質(zhì)的形成過(guò)程。組織工程化牙本質(zhì)能夠誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞在其表面形成牙骨質(zhì)和垂直排列的致密膠原纖維束，從而共同組成了組織工程