組織工程周圍神經的構建及其應用基礎研究.pdf

1、本課題旨在研制組織工程周圍神經，以解決長段神經損傷修復中供體神經來源缺乏問題。包括導管材料制備與表征、導管制作、神經生長因子的固定化、種子細胞的分離培養(yǎng)，并對所構建的組織工程周圍神經進行了系統(tǒng)的功能評價，以明確各影響因素在坐骨神經損傷后修復過程中的作用。
　　 殼聚糖(chitosan，CS)是一種天然的聚陽離子多糖，具有無毒、生物可降解、不會引起排異反應等特點。但由于其脆性較高，不易加工，因而應用受到一些限制。聚乳酸(poly

2、lactide，PLA)具有優(yōu)良的機械力學性能，對人體無毒、無刺激、可以被人體吸收，因而已被美國食品和藥品管理局(FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準用作藥物控釋載體及修復材料。但PLA存在親水性及組織相容性差，降解產物會引起局部酸性炎癥等不足。本課題采用接枝共聚法制備殼聚糖/聚乳酸的復合材料，以達到整合兩者優(yōu)點，克服兩者不足的目的。
　　 靜電自組裝（electrostaticself-assemb

3、ly，ESA）技術已成為一種日益引起廣大生物材料工作者興趣的新型制備方法，它是基于相反電荷電解質相互吸附的超薄膜形成技術。該技術操作簡單、成膜穩(wěn)定性好、不受基材形狀和大小的限制?，F(xiàn)已在生物材料改性、藥物緩釋、生物傳感器制備等領域廣泛應用。本課題采用靜電自組裝技術，將殼聚糖及肝素固定在5/0手術縫合線表面，制備神經引導絲。并通過1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-eth

4、ylcarbodiimidehydrochloride，EDC）交聯(lián)將神經生長因子（nervegrowthfactor,NGF）固定于神經引導絲及導管支架材料表面，以達到緩釋NGF的作用。
　　 組織工程神經導管的種子細胞中雪旺細胞是最理想的，其作用包括分泌多種神經營養(yǎng)因子和細胞外基質，表達粘附分子，引導軸突再生等。但雪旺細胞本身是一種終末期細胞，體外培養(yǎng)的增殖能力差，很難達到移植所需的理想數(shù)量，且自體取材易造成新的損傷，故使其

5、在臨床使用中受到一定的限制。骨髓來源的干細胞是較為理想的雪旺細胞替代細胞。本課題采用骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)作為種子細胞。
　　 隨著交通方式的改變及機械化大生產的發(fā)展，當前每年都有大量人員遭受周圍神經損傷。顯微外科手術仍是現(xiàn)階段臨床上廣泛采用的治療手段，對于5mm以上的神經損傷只能采用自體移植方法，但神經來源有限，且會造成新的損傷。因此研究者開始將著眼于采用組

6、織工程技術修復長距離的神經損傷。該領域重點問題包括:①神經導管材料選擇和表面形態(tài)修飾。②神經導管與神經營養(yǎng)因子的聯(lián)合應用。③選擇并添加合適的種子細胞。本課題的工作即在此領域展開，主要包括:
　　 1.殼聚糖/聚乳酸復合材料的構建及性能研究
　　 采用接枝共聚法制備殼聚糖/聚乳酸復合材料，并利用固態(tài)核磁、單反射紅外光譜、X射線衍射及掃描電子顯微鏡對其理化性質進行表征。測定殼聚糖氨基取代度、乳酸聚合度、孔隙率、溶脹性能、體內

7、外降解速率、體外降解pH變化及細胞親和性、組織相容性。結果表明，隨乳酸與殼聚糖質量比的增大，復合材料孔隙率和溶脹性能逐漸減小，體外降解pH呈波動性變化，且隨乳酸量的增大波動性逐漸增大，體內外降解質量減少隨乳酸量的增大逐漸增大，在所設的三種比例下，復合材料的細胞親和性和組織相容性都較好。
　　 2.組織工程神經的構建
　　 2.1殼聚糖/聚乳酸復合材料神經導管的制備
　　 采用自制模具，利用冷凍干燥及高溫真空干燥方

8、法制備復合材料導管支架。并對其力學性能及超微結構進行測定。結果表明，復合材料導管與殼聚糖導管相比可有效提高力學性能，且導管支架呈瓦片狀，能夠有效防止周圍組織的長入，同時有利于損傷神經進行物質交換，能夠為神經的再生提供良好的微環(huán)境。
　　 2.2神經引導絲的靜電自組裝修飾
　　 采用可降解的聚乙醇酸5/0手術縫合線為載體，在其表面制備聚乳酸涂層，利用靜電自組裝技術在其表面制備殼聚糖/肝素多層膜結構，并通過紅外光譜、X射線光

9、電子能譜及掃描電子顯微鏡進行表征。結果表明，神經引導絲表面已形成殼聚糖/肝素多層膜。并且在復合神經導管后，可有效地增大導管的內表面積。
　　 2.3NGF的交聯(lián)固定
　　 采用EDC交聯(lián)方式在神經引導絲及導管支架上固定NGF，以達到在神經修復期間緩釋NGF的作用。結果表明，經釋放前期其呈現(xiàn)突釋，但隨時間的延長其逐漸呈平穩(wěn)釋放;且由于表面積大的原因，神經導管固定NGF的量明顯多于神經引導絲。
　　 2.4BMSCs

10、作為種子細胞的分離及熒光標記
　　 采用市售試劑盒，按照密度梯度離心法分離大鼠BMSCs與并與神經導管復合構建組織工程神經，應用于大鼠坐骨神經損傷修復，采用Hoechst33258對BMSCs進行標記，結合免疫組化方法檢測其分化狀態(tài)。結果表明在手術6w后BMSCs依然存活，并且有nestin的表達，表明其已經分化為類神經元細胞。
　　 3.組織工程神經對大鼠坐骨神經損傷修復的效果觀察及初步機制研究
　　 采用大鼠

11、坐骨神經損傷模型，以神經電生理指數(shù)，坐骨神經功能指數(shù)(SFI)，神經的纖維密度、直徑及nestin免疫組化為考察指標，對比研究了空白組、造模組、自體移植組、組織工程神經組、導管復合NGF組、導管復合干細胞組、固定有NGF的引導絲組、靜電自組裝修飾后的引導絲組、吡咯喹啉醌組、復合材料各組、殼聚糖組、聚乳酸組修復坐骨神經損傷的效果，按效果從優(yōu)到劣的排序是:自體移植組、組織工程神經組、NGF組、干細胞組、生長因子引導絲組、自組裝引導絲組、吡咯

12、喹啉醌組、復合材料-Ⅱ組、復合材料-Ⅰ組、復合材料-Ⅲ組、殼聚糖組、聚乳酸組、造模組。熒光標記和免疫組織化學檢測表明，nestin在組織工程神經組及干細胞組均有表達，表明BMSCs向神經干細胞的方向進行了分化，推測這是所構建的組織工程神經具有良好修復作用的機制。
　　 本研究取得的主要研究成果有:
　　 1.制備了殼聚糖/聚乳酸復合材料并對其理化性能，體內外降解性能，細胞親和性及組織相容性進行評價，為制備適宜的組織工程材

13、料提供依據(jù)。
　　 2.利用靜電自組裝技術修飾神經引導絲，在其表面制備肝素/殼聚糖膜，并對其理化性質進行表征;利用EDC交聯(lián)固定NGF，體外檢測顯示其可緩釋NGF;利用模具制作殼聚糖/聚乳酸復合材料支架。研究表明，復合材料-Ⅱ組的力學性能和微觀結構更有利于損傷神經的修復。
　　 3.評價了各影響因素在大鼠周圍神經損傷后修復中的效果。結果顯示各組修復情況排序為:自體移植組、組織工程神經組、NGF組、干細胞組、生長因子引導絲