組織工程化周圍神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章大鼠去細(xì)胞組織工程化神經(jīng)支架的制備及形態(tài)學(xué)研究 目的：采取化學(xué)處理方法，去除大鼠周圍神經(jīng)中的細(xì)胞和髓鞘以取得去細(xì)胞的組織工程化神經(jīng)支架。 方法：10只SD大鼠，共20條坐骨神經(jīng)分為2組，每組10條。分別為正常神經(jīng)對(duì)照組和化學(xué)去細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組。然后在光鏡和電鏡下對(duì)各組神經(jīng)組織行組織學(xué)結(jié)構(gòu)觀察，通過(guò)免疫組織化學(xué)分析其成分。 結(jié)果：去細(xì)胞神經(jīng)呈淡乳白色圓柱狀外觀，略透亮，其延展性較化學(xué)處理前略增加。經(jīng)脫細(xì)胞處理后，去

2、除了Schwann細(xì)胞、神經(jīng)纖維的髓鞘和軸突，保存了由Schwann細(xì)胞基底膜管以及神經(jīng)外膜和束膜的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的三維支架結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：化學(xué)處理所獲得的去細(xì)胞神經(jīng)在組織結(jié)構(gòu)和成分上已經(jīng)達(dá)到了相應(yīng)的要求，能否成為有效的神經(jīng)移植修復(fù)材料，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。 第二章大鼠脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)及向類Schwann細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 目的：掌握大鼠脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增的方法，并探討其生物學(xué)特性及向類Schwa

3、nn細(xì)胞方向分化的條件。 方法：無(wú)菌技術(shù)下切取近交系大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊，加入適量Ⅰ型膠原酶消化獲取脂肪干細(xì)胞，接種入含10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。取傳代細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原標(biāo)志CD<,29>、CD<,34>、CD<,44>；四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT法)測(cè)定第1、4、10代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；原代細(xì)胞傳代至第4代，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)情況、誘導(dǎo)前后的形態(tài)學(xué)變化，

4、S-100、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色并計(jì)算其陽(yáng)性率和染色灰度值。 結(jié)果：原代培養(yǎng)顯示原代細(xì)胞3天左右開(kāi)始貼壁，呈梭形成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，8d左右可達(dá)90％融合，呈旋渦狀排列，形成集落。傳代后2～4h開(kāi)始貼壁，經(jīng)過(guò)較短的潛伏期后開(kāi)始增殖，3d即可長(zhǎng)滿。10代以后細(xì)胞傳代后潛伏期延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖速度逐漸減慢。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果有95％的細(xì)胞表達(dá)CD<,44>，96％的細(xì)胞表達(dá)CD<,29>，而只有5％的細(xì)胞表達(dá)CD<,34>。生長(zhǎng)曲線顯

5、示第1、4代大鼠脂肪干細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，以第4代細(xì)胞為甚，第10代細(xì)胞增殖能力減弱。依次加入誘導(dǎo)劑后部分細(xì)胞向Schwann細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，免疫細(xì)胞化學(xué)染色S-100、GFAP呈陽(yáng)性表達(dá)。誘導(dǎo)至第4d時(shí)細(xì)胞染色陽(yáng)性率及灰度值優(yōu)于誘導(dǎo)2d,8d組。 結(jié)論：1．從大鼠脂肪組織中可以有效地分離、培養(yǎng)具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性的脂肪干細(xì)胞。2．脂肪干細(xì)胞可以在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為類Schwann細(xì)胞。 第三章經(jīng)誘導(dǎo)分化的大鼠脂肪干細(xì)胞用于

6、構(gòu)建組織工程化周圍神經(jīng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：應(yīng)用去細(xì)胞神經(jīng)支架及誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞構(gòu)成組織工程化周圍神經(jīng)，了解兩者相容性，以及組織工程化周圍神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)效果，為臨床研究提供資料。 方法：按照前述方法培養(yǎng)并誘導(dǎo)近交系大鼠脂肪干細(xì)胞向類Schwann分化，將誘導(dǎo)分化的脂肪干細(xì)胞懸液注入己制備的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架管中，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；掃描電鏡下觀察細(xì)胞在材料上附著情況；四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT法)

7、測(cè)定細(xì)胞活性；取兩組近交系大鼠，分別用組織工程化神經(jīng)和自體神經(jīng)橋接10mm神經(jīng)缺損，通過(guò)大體觀察、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)率(SFI％)的測(cè)定、神經(jīng)電生理(NEP)的測(cè)定、組織學(xué)光鏡觀察、透射電鏡觀察、再生有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)恢復(fù)率、神經(jīng)纖維直徑恢復(fù)率、髓鞘厚度恢復(fù)率的測(cè)定等指標(biāo)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)效果。 結(jié)果：1w后掃描電鏡下可見(jiàn)接種的類Schwann細(xì)胞分散在材料表面的孔隙內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)為星狀，細(xì)胞突起與支架管壁粘附；MTT法測(cè)定細(xì)胞活性示神經(jīng)支

8、架組在各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；12w時(shí)兩組動(dòng)物坐骨神經(jīng)外觀、組織學(xué)光鏡觀察、透射電鏡觀察結(jié)果相似、兩組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)恢復(fù)率(SFI％)、神經(jīng)電生理(NEP)、再生有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)恢復(fù)率、神經(jīng)纖維直徑恢復(fù)率、髓鞘厚度恢復(fù)率等指標(biāo)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：1．去細(xì)胞同種異體神經(jīng)與類Schwann細(xì)胞的組織相容性好，未見(jiàn)明顯排異反應(yīng)。2．兩者構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)能有效地修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，其效