油菜矮化突變體莖段伸長初期莖尖差異表達基因的初步分析.pdf

1、“NDF-1”是利用快中子轟擊及硫酸二乙酯(DES)聯(lián)合處理甘藍型油菜高稈品系，然后再自交純合后育成的矮化突變體，其株高僅及親本的三分之一?！癗DF-1”在油菜抗倒伏及半矮稈雜交種選育中具有重要的作用。本文應用抑制性消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)技術構建了甘藍型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長初期的抑制性消減文庫，對差異表達基因進行分析，為探究油菜矮化突變的分子機理及克

2、隆該基因應用于油菜品種基因工程改良奠定基礎。 首先，應用SSH技術，以矮稈突變株系“NDF-1”為Tester、高稈野生型“3529”為Driver，構建了甘藍型油菜矮化突變體“NDF-1”莖段伸長初期莖尖的抑制性消減文庫。經菌落PCR檢測，消減文庫的有效重組率為58％，其中插入的cDNA片段大小在100 bp到500bp之間。通過斑點雜交對88個隨機挑選的含有插入片段的陽性克隆進行初步差異篩選，然后選取了30個陽性克隆進行序列

3、測定。除7個克隆未出現(xiàn)測序結果外，其余克隆均獲得了DNA序列結果。對cDNA序列在GenBank數據庫中進行同源性比較。其中13個有比較明確的比對結果：其中1個和信號轉導有關，2個和植物抗病性有關，1個和蛋白質的泛素化降解有關，1個和脂肪酸轉運有關；另外有8個克隆為功能未知的蛋白質。 其次，在SSH文庫克隆序列分析的基礎上，以甘藍型油菜(Brassica napus)矮化突變體“NDF-1”莖尖為材料提取RNA，采用RACE技術

4、對編碼幾丁質酶基因的G6克隆的3’端片段進行了RACE擴增，獲得3’端片段序列長度為344bp，在GenBank中進行比對(blast)分析。結果表明，與幾丁質酶基因核苷酸和蛋白質同源性分別為86％和84％。根據G6克隆的已知序列設計特異引物并應用逆轉錄合成的cDNA和PCR技術，檢測其在野生型與矮化突變體不同部位的差異表達。結果顯示，該基因僅在矮化突變體莖尖部位有比較明顯的表達；在矮化突變體根、莖、子葉和成熟葉片部位無表達；在野生型根