尼羅羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達(dá)譜分析及Siglecs基因的表達(dá)研究.pdf

1、尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)隸屬于鱸形目(Percifomes)、麗魚(yú)科(Cichlidae)、羅非魚(yú)屬(Tilapia)。因其具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、繁殖力高和食性廣等優(yōu)點(diǎn),被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織定為向世界各國(guó)推薦的養(yǎng)殖對(duì)象。中國(guó)為羅非魚(yú)養(yǎng)殖的主要國(guó)家,羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到每年120萬(wàn)噸,占世界羅非魚(yú)總產(chǎn)量的近50％。但近年來(lái),由于養(yǎng)殖密度高、養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因,養(yǎng)殖羅非魚(yú)暴發(fā)了鏈球菌病,導(dǎo)致養(yǎng)殖羅非魚(yú)的大量死亡,造

2、成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并威脅著羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究分析了無(wú)乳鏈球菌攻毒前后尼羅羅非魚(yú)的轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital Gene Expression, DGE)以探究細(xì)菌感染造成的羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組變化,進(jìn)而選定了重要免疫受體基因Siglecs進(jìn)行克隆以及序列分析和組織表達(dá)研究。這些研究將有助于加深認(rèn)識(shí)羅非魚(yú)抵御病原菌入侵的免疫應(yīng)答機(jī)制,為制定合理有效的羅非魚(yú)鏈球菌病防控措施以及羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。
　

3、　1.受無(wú)乳鏈球菌感染的尼羅羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組與數(shù)字基因表達(dá)譜分析
　　本研究應(yīng)用 Illumina RNA-seq技術(shù)進(jìn)行尼羅羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組研究,經(jīng)SOAPdenovo軟件拼接組裝,最終得到82,799 Unigenes(平均大小:618 bp)。Unigenes通過(guò)與Nr, Swissprot, COG(Cluster of Orthologous Groups of proteins), KEGG(Kyoto Encyclopedi

4、a of Genes and Genomes)以及 GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastX比對(duì),得到功能注釋。以此轉(zhuǎn)錄組拼接Unigenes作為參考序列,結(jié)合DGE技術(shù),我們對(duì)無(wú)乳鏈球菌攻毒前后的尼羅羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行研究。結(jié)果得到774條表達(dá)顯著上調(diào)的Unigenes以及625條表達(dá)顯著下調(diào)的Unigenes,其中,293個(gè)差異表達(dá)基因能夠注釋到181條信號(hào)通路中,包括17條免疫相關(guān)的信號(hào)通路(涉及65個(gè)差異表達(dá)基

5、因)。另外,我們還對(duì) Toll-like receptor信號(hào)通路中的6個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè),結(jié)果驗(yàn)證了DGE分析的可靠性。本研究得到的大量轉(zhuǎn)錄組組裝序列豐富了羅非魚(yú)基因序列資源,得到的差異表達(dá)基因及其相關(guān)通路分析為進(jìn)一步了解羅非魚(yú)抗鏈球菌感染機(jī)制以及其他免疫相關(guān)研究提供了寶貴資源。
　　2.尼羅羅非魚(yú)Siglec基因的克隆與組織表達(dá)分析
　　克隆得到尼羅羅非魚(yú) Siglec-1和 Siglec-1

6、4基因。Siglec-1基因的ORF為1350bp,編碼氨基酸449個(gè)。蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示, Siglec-1具有信號(hào)肽1個(gè),Ig-like結(jié)構(gòu)域3個(gè),跨膜結(jié)構(gòu)域1個(gè)以及胞質(zhì)區(qū)ITIM結(jié)構(gòu)域1個(gè)。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,魚(yú)類(lèi)的Siglec-1聚為一支,哺乳類(lèi)的則聚為另一支。Siglec-14基因的ORF為921bp,編碼氨基酸306個(gè)。蛋白初級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,Siglec-14具有信號(hào)肽1個(gè),Ig-like結(jié)構(gòu)域2個(gè),跨膜結(jié)構(gòu)域1個(gè)。實(shí)