基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序的垂體ACTH腺瘤mRNA及microRNA表達譜分析.pdf

1、垂體腺瘤是常見的顱內(nèi)良性腫瘤之一，發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤第二位，約占顱內(nèi)腫瘤的10％-15％，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。隨著腫瘤不斷生長，可壓迫蝶鞍區(qū)周圍結(jié)構(gòu)，如視神經(jīng)、海綿竇、腦底動脈、下丘腦等，甚至累及額葉、腦干，而導致嚴重的功能障礙。同時，腫瘤生長還可導致垂體激素分泌紊亂。按照外周血激素水平，垂體腺瘤分為無功能型垂體腺瘤(NFPA)和功能型垂體腺瘤，包括:泌乳素腺瘤(PRL)、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(Cushing)、生長激素腺瘤(GH)、促

2、甲狀腺激素腺瘤(TSH)、促性腺激素腺瘤(PGA)以及混合激素分泌腺瘤等。其中垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(ACTH-PAs)臨床又稱為庫欣病(Cushing's Disease)是一種伴有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌的功能型垂體腺瘤約占全部垂體腺瘤的14％，約占庫欣綜合征(Cushing's syndrome)的70％。該病在歐美國家的發(fā)病率為39/百萬，我國尚缺乏大規(guī)模流行病學數(shù)據(jù)。由于該病的診斷主要基于實驗室激素水平檢查、患者臨床

3、癥狀體征、影像學檢查及病理學免疫組織化學檢測，因此對于庫欣病的早期診斷十分困難，容易誤診?；颊叱３Ｓ捎诟咂べ|(zhì)醇血癥而引起多種嚴重并發(fā)癥，如高血壓、糖尿病、高脂血癥、骨質(zhì)疏松及精神抑郁等就診。在治療上，對于絕大多數(shù)庫欣病人而言，經(jīng)鼻蝶竇入路垂體腺瘤切除術(shù)仍然是臨床首選治療方法，放射治療以及帕瑞肽、酮康唑等藥物治療常作為難治性庫欣病的術(shù)后輔助治療方式。雖然文獻報道外科手術(shù)成功率在65％～90％，但是由于腫瘤自身生物學行為的不同及術(shù)者操作水平

4、的差異，腫瘤復(fù)發(fā)率為3％～47％，平均復(fù)發(fā)時間為16～49個月，復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差，病死率高。近年來針對庫欣病的分子水平研究主要集中在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤的侵襲性及激素分泌等方面，但目前對于庫欣病的發(fā)病機制尚不完全清楚，因此臨床上亟待尋找有助于庫欣病診斷、治療及判斷預(yù)后的潛在靶點。
　　本研究通過新一代測序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)，對垂體ACTH腺瘤全轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序，在轉(zhuǎn)錄組水平篩

5、選相關(guān)差異表達基因和microRNA;并與患者臨床表型進行關(guān)聯(lián)分析，探究垂體ACTH腺瘤所致臨床表型的分子機理，此外，考慮到血清游離miRNA具有作為腫瘤標志物的潛力，篩選差異表達的血清miRNA，并對差異表達的血清miRNA進行了驗證，為深入研究庫欣病的發(fā)病機制，篩選診斷標志物提供依據(jù)。以期最終實現(xiàn)垂體腺瘤患者個性化治療。
　　第一部分 基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序的垂體ACTH腺瘤mRNA差異表達分析
　　目的:通過新一代高通量

6、測序技術(shù)對垂體ACTH腺瘤行轉(zhuǎn)錄組測序，探究垂體ACTH腺瘤與瘤周正常垂體組織間的差異表達基因，以期揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能的存在分子機制，并為后續(xù)的microRNA組學研究提供完整的分子生物學基礎(chǔ)。
　　方法:收集單一中心68例垂體ACTH患者的組織標本（腫瘤及瘤周正常垂體），20例無功能垂體腺瘤，18例生長激素型垂體腺瘤和8例泌乳素型垂體腺瘤，同時采集患者相關(guān)臨床信息。運用新一代測序技術(shù)對9對配對樣本（腫瘤和瘤周正常垂體組織

7、）進行轉(zhuǎn)錄組深度測序，通過生物信息學分析，獲取垂體ACTH腺瘤基因差異表達譜。進一步對篩選出的差異表達基因行GO term和PATHWAY分析，并挑選差異表達顯著基因進行驗證和功能機制研究，探究其在垂體ACTH腺瘤中可能存在的分子調(diào)節(jié)機制。
　　結(jié)果:通過對垂體ACTH腺瘤mRNA-seq數(shù)據(jù)做生物信息學分析，我們篩選出166個上調(diào)的差異表達基因和288個下調(diào)的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)了庫欣病腫瘤發(fā)生發(fā)展、激素分泌和腫瘤侵襲性等相關(guān)的基

8、因和相關(guān)信號通路。并從中挑選未經(jīng)報道的TIMP3基因做進一步驗證，發(fā)現(xiàn)與瘤周正常垂體組織相比TIMP3在mRNA和蛋白水平的表達在各類型垂體腺瘤中顯著下調(diào)，并與腫瘤的體積、侵襲性、Ki-67等顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:通過建立垂體ACTH腺瘤基因的差異表達譜，揭示庫欣病可能存在的發(fā)病機制及臨床表型相關(guān)機制，并為后續(xù)的庫欣病microRNA組學分子靶向研究提供理論基礎(chǔ)。
　　第二部分 基于全轉(zhuǎn)錄組深度測序的垂體ACTH腺瘤micr

9、oRNAs差異表達分析
　　目的:運用新一代測序技術(shù)，建立垂體ACTH腺瘤microRNA差異表達譜。鑒定相關(guān)microRNA在垂體ACTH腺瘤組織中及患者血清中的表達情況，以期作為診斷庫欣病和預(yù)后監(jiān)測的分子標志物。
　　方法:經(jīng)蝶竇入路手術(shù)治療庫欣病患者，術(shù)中收集垂體ACTH腺瘤患者腫瘤標本及瘤周垂體組織共9對。運用Illumina Genome AnalyzerⅡx行全轉(zhuǎn)錄組microRNA測序，結(jié)合生物信息學分析建立垂

10、體ACTH腺瘤差異表達的microRNA譜。并在55例腫瘤組織和15例瘤周正常垂體組織中運用熒光定量PCR進行驗證，將篩選得到的microRNA在197例病人和120例健康人的血清中運用熒光定量PCR行驗證檢測，并進行靶基因的預(yù)測及與第一部分mRNA-seq結(jié)果做關(guān)聯(lián)分析，在組織水平作相關(guān)基因功能驗證，得到一組microRNA panel作為針對庫欣病診斷和預(yù)后觀察的分子標志物。
　　結(jié)果:所有9對樣品建庫成功，Illumina

11、Genome AnalyzerⅡx深度測序平均讀取10M/樣品。我們發(fā)現(xiàn)，垂體ACTH腺瘤與瘤周垂體相比，有67個microRNA顯著差異表達。通過對測序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，垂體ACTH腺瘤相對瘤周正常垂體組織比較，根據(jù)Fold change＞2，Recurrence≥5，發(fā)現(xiàn)67個差異表達的microRNA，其中包括39個上調(diào)的microRNA和28個下調(diào)的microRNA，在腫瘤和瘤周正常垂體組織中驗證得到6個上調(diào)（miR-9-5p，mi

12、R-9-3p，miR-190b，miR-137，miR-885-5p，miR-592）和1個下調(diào)的mir-551b-3p，并且在患者和正常人的血清中進行檢測，也得到了1個下調(diào)的mir-551b-3p，其表達水平與組織中一致。受試者工作特征曲線分析顯示，mir-551b-3p對于庫欣病的診斷具有較高的敏感性和特異性。血清中mir-551b-3p的表達水平與患者的腫瘤體積，血皮質(zhì)醇和ACTH水平顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明mic