基于全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序的垂體ACTH腺瘤mRNA及microRNA表達(dá)譜分析.pdf

1、垂體腺瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)良性腫瘤之一，發(fā)病率居顱內(nèi)腫瘤第二位，約占顱內(nèi)腫瘤的10％-15％，并呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。隨著腫瘤不斷生長(zhǎng)，可壓迫蝶鞍區(qū)周圍結(jié)構(gòu)，如視神經(jīng)、海綿竇、腦底動(dòng)脈、下丘腦等，甚至累及額葉、腦干，而導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙。同時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)還可導(dǎo)致垂體激素分泌紊亂。按照外周血激素水平，垂體腺瘤分為無(wú)功能型垂體腺瘤(NFPA)和功能型垂體腺瘤，包括:泌乳素腺瘤(PRL)、促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(Cushing)、生長(zhǎng)激素腺瘤(GH)、促

2、甲狀腺激素腺瘤(TSH)、促性腺激素腺瘤(PGA)以及混合激素分泌腺瘤等。其中垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤(ACTH-PAs)臨床又稱為庫(kù)欣病(Cushing's Disease)是一種伴有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)分泌的功能型垂體腺瘤約占全部垂體腺瘤的14％，約占庫(kù)欣綜合征(Cushing's syndrome)的70％。該病在歐美國(guó)家的發(fā)病率為39/百萬(wàn)，我國(guó)尚缺乏大規(guī)模流行病學(xué)數(shù)據(jù)。由于該病的診斷主要基于實(shí)驗(yàn)室激素水平檢查、患者臨床

3、癥狀體征、影像學(xué)檢查及病理學(xué)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，因此對(duì)于庫(kù)欣病的早期診斷十分困難，容易誤診。患者常常由于高皮質(zhì)醇血癥而引起多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如高血壓、糖尿病、高脂血癥、骨質(zhì)疏松及精神抑郁等就診。在治療上，對(duì)于絕大多數(shù)庫(kù)欣病人而言，經(jīng)鼻蝶竇入路垂體腺瘤切除術(shù)仍然是臨床首選治療方法，放射治療以及帕瑞肽、酮康唑等藥物治療常作為難治性庫(kù)欣病的術(shù)后輔助治療方式。雖然文獻(xiàn)報(bào)道外科手術(shù)成功率在65％～90％，但是由于腫瘤自身生物學(xué)行為的不同及術(shù)者操作水平

4、的差異，腫瘤復(fù)發(fā)率為3％～47％，平均復(fù)發(fā)時(shí)間為16～49個(gè)月，復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差，病死率高。近年來(lái)針對(duì)庫(kù)欣病的分子水平研究主要集中在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤的侵襲性及激素分泌等方面，但目前對(duì)于庫(kù)欣病的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此臨床上亟待尋找有助于庫(kù)欣病診斷、治療及判斷預(yù)后的潛在靶點(diǎn)。
　　本研究通過(guò)新一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)，對(duì)垂體ACTH腺瘤全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組水平篩

5、選相關(guān)差異表達(dá)基因和microRNA;并與患者臨床表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，探究垂體ACTH腺瘤所致臨床表型的分子機(jī)理，此外，考慮到血清游離miRNA具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛力，篩選差異表達(dá)的血清miRNA，并對(duì)差異表達(dá)的血清miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證，為深入研究庫(kù)欣病的發(fā)病機(jī)制，篩選診斷標(biāo)志物提供依據(jù)。以期最終實(shí)現(xiàn)垂體腺瘤患者個(gè)性化治療。
　　第一部分 基于全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序的垂體ACTH腺瘤mRNA差異表達(dá)分析
　　目的:通過(guò)新一代高通量

6、測(cè)序技術(shù)對(duì)垂體ACTH腺瘤行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究垂體ACTH腺瘤與瘤周正常垂體組織間的差異表達(dá)基因，以期揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能的存在分子機(jī)制，并為后續(xù)的microRNA組學(xué)研究提供完整的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:收集單一中心68例垂體ACTH患者的組織標(biāo)本（腫瘤及瘤周正常垂體），20例無(wú)功能垂體腺瘤，18例生長(zhǎng)激素型垂體腺瘤和8例泌乳素型垂體腺瘤，同時(shí)采集患者相關(guān)臨床信息。運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)9對(duì)配對(duì)樣本（腫瘤和瘤周正常垂體組織

7、）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析，獲取垂體ACTH腺瘤基因差異表達(dá)譜。進(jìn)一步對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因行GO term和PATHWAY分析，并挑選差異表達(dá)顯著基因進(jìn)行驗(yàn)證和功能機(jī)制研究，探究其在垂體ACTH腺瘤中可能存在的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　結(jié)果:通過(guò)對(duì)垂體ACTH腺瘤mRNA-seq數(shù)據(jù)做生物信息學(xué)分析，我們篩選出166個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因和288個(gè)下調(diào)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)了庫(kù)欣病腫瘤發(fā)生發(fā)展、激素分泌和腫瘤侵襲性等相關(guān)的基

8、因和相關(guān)信號(hào)通路。并從中挑選未經(jīng)報(bào)道的TIMP3基因做進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與瘤周正常垂體組織相比TIMP3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)在各類型垂體腺瘤中顯著下調(diào)，并與腫瘤的體積、侵襲性、Ki-67等顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:通過(guò)建立垂體ACTH腺瘤基因的差異表達(dá)譜，揭示庫(kù)欣病可能存在的發(fā)病機(jī)制及臨床表型相關(guān)機(jī)制，并為后續(xù)的庫(kù)欣病microRNA組學(xué)分子靶向研究提供理論基礎(chǔ)。
　　第二部分 基于全轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序的垂體ACTH腺瘤micr

9、oRNAs差異表達(dá)分析
　　目的:運(yùn)用新一代測(cè)序技術(shù)，建立垂體ACTH腺瘤microRNA差異表達(dá)譜。鑒定相關(guān)microRNA在垂體ACTH腺瘤組織中及患者血清中的表達(dá)情況，以期作為診斷庫(kù)欣病和預(yù)后監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物。
　　方法:經(jīng)蝶竇入路手術(shù)治療庫(kù)欣病患者，術(shù)中收集垂體ACTH腺瘤患者腫瘤標(biāo)本及瘤周垂體組織共9對(duì)。運(yùn)用Illumina Genome AnalyzerⅡx行全轉(zhuǎn)錄組microRNA測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析建立垂

10、體ACTH腺瘤差異表達(dá)的microRNA譜。并在55例腫瘤組織和15例瘤周正常垂體組織中運(yùn)用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，將篩選得到的microRNA在197例病人和120例健康人的血清中運(yùn)用熒光定量PCR行驗(yàn)證檢測(cè)，并進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)及與第一部分mRNA-seq結(jié)果做關(guān)聯(lián)分析，在組織水平作相關(guān)基因功能驗(yàn)證，得到一組microRNA panel作為針對(duì)庫(kù)欣病診斷和預(yù)后觀察的分子標(biāo)志物。
　　結(jié)果:所有9對(duì)樣品建庫(kù)成功，Illumina

11、Genome AnalyzerⅡx深度測(cè)序平均讀取10M/樣品。我們發(fā)現(xiàn)，垂體ACTH腺瘤與瘤周垂體相比，有67個(gè)microRNA顯著差異表達(dá)。通過(guò)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，垂體ACTH腺瘤相對(duì)瘤周正常垂體組織比較，根據(jù)Fold change＞2，Recurrence≥5，發(fā)現(xiàn)67個(gè)差異表達(dá)的microRNA，其中包括39個(gè)上調(diào)的microRNA和28個(gè)下調(diào)的microRNA，在腫瘤和瘤周正常垂體組織中驗(yàn)證得到6個(gè)上調(diào)（miR-9-5p，mi

12、R-9-3p，miR-190b，miR-137，miR-885-5p，miR-592）和1個(gè)下調(diào)的mir-551b-3p，并且在患者和正常人的血清中進(jìn)行檢測(cè)，也得到了1個(gè)下調(diào)的mir-551b-3p，其表達(dá)水平與組織中一致。受試者工作特征曲線分析顯示，mir-551b-3p對(duì)于庫(kù)欣病的診斷具有較高的敏感性和特異性。血清中mir-551b-3p的表達(dá)水平與患者的腫瘤體積，血皮質(zhì)醇和ACTH水平顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明mic